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Sep 02, 2023

Actividades estacionales del microbioma de la filosfera de cultivos perennes.

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 1039 (2023) Cita este artículo 5666 Accesos 1 Citas 79 Detalles de Altmetric Metrics Comprensión de las interacciones entre plantas y microorganismos

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 1039 (2023) Citar este artículo

5666 Accesos

1 Citas

79 altmétrico

Detalles de métricas

Comprender las interacciones entre plantas y microorganismos puede informar el manejo del microbioma para mejorar la productividad de los cultivos y la resistencia al estrés. Aquí, aplicamos un enfoque centrado en el genoma para identificar miembros del microbioma foliar ecológicamente importantes en parcelas replicadas de pasto varilla y miscanthus cultivados en el campo, y para cuantificar sus actividades durante dos temporadas de crecimiento para pasto varilla. Utilizamos secuenciación de metagenomas y metatranscriptomas y seleccionamos 40 genomas ensamblados en metagenomas (MAG) de calidad media y alta. Encontramos que las clases representadas por estos MAG (Actinomycetia, Alpha- and Gamma-Proteobacteria y Bacteroidota) están activas al final de la temporada y regulan positivamente las transcripciones de la deshidrogenasa de cadena corta, la molibdopterina oxidorreductasa y la policétido ciclasa. Las vías asociadas al estrés se expresan en la mayoría de los MAG, lo que sugiere un compromiso con el entorno anfitrión. También detectamos vías biosintéticas activadas estacionalmente para terpenos y varias vías de péptidos no ribosomales que están mal comentadas. Nuestros hallazgos respaldan que las poblaciones de bacterias asociadas a las hojas son estacionalmente dinámicas y responden a las señales del huésped.

Las plantas perennes son un objetivo crucial para el desarrollo sostenible de los biocombustibles1,2,3. Además de producir una gran cantidad de biomasa que puede convertirse en biocombustibles y bioproductos, los cultivos perennes ofrecen una amplia gama de servicios ecosistémicos que apoyan los esfuerzos para mediar el cambio climático, incluida la mitigación de los gases de efecto invernadero y la promoción del ciclo de los nutrientes del suelo1,4,5,6. Como todas las plantas, las plantas perennes albergan una microbiota diversa, y se sabe o se espera que muchos de estos microbios beneficien a sus huéspedes. Por ejemplo, los microbios asociados a las plantas pueden aumentar la productividad y proteger contra factores estresantes ambientales. Debido al estrecho compromiso de muchos miembros del microbioma asociado a plantas con el huésped, el manejo del microbioma vegetal es una herramienta propuesta para promover el vigor de los cultivos y apoyar su resiliencia a los cambios climáticos globales7,8,9,10. Por lo tanto, junto con la cría selectiva y la gestión de campo basada en datos, se espera que la regulación del microbioma vegetal sea estratégica para la producción sostenible de materias primas para biocombustibles.

Las plantas tienen compartimentos anatómicos y cada uno de ellos está habitado por consorcios microbianos distintivos. Generalmente, la diversidad y composición del microbioma vegetal se estrecha desde los compartimentos externos a los internos, y la planta desempeña un papel activo en el filtrado de la composición del microbioma hacia el interior11,12,13. Los compartimentos externos de las plantas incluyen la zona de las raíces, la rizosfera y el rizoplano debajo del suelo, y la filosfera epífita sobre el suelo14. Los compartimentos externos tienen una representación relativamente mayor de taxones microbianos comensales o transitorios, y estos compartimentos interactúan con microbios del entorno inmediato y los reclutan. Los compartimentos internos incluyen la endosfera de los tejidos aéreos y subterráneos, y estos tienen una riqueza relativamente baja y albergan la microbiota más seleccionada15,16. De estos compartimentos, la rizosfera ha recibido la mayor atención como un sitio crítico de interacciones microbianas-plantas que son importantes para la adquisición de nutrientes y agua (por ejemplo, Kuzyakov y Razavi17). Sin embargo, los miembros de la microbiota que habitan la filosfera también desempeñan funciones importantes en las plantas, como la exclusión de patógenos y la preparación inmune18,19. Los microorganismos de la filosfera tienen adaptaciones especializadas a su estilo de vida expuesto16,20,21,22 y contribuyen al ciclo global del carbono y otros ciclos biogeoquímicos, incluidas transformaciones relevantes para el cambio climático23,24,25, y habitan la mayor superficie aérea26. Debido a que las materias primas para biocombustibles perennes a menudo se seleccionan para maximizar la superficie del follaje, se espera que comprender el microbioma de la filosfera proporcione información sobre las interacciones microbianas que benefician a la planta para respaldar la productividad y la resistencia al estrés.

Hay dos desafíos generales en la regulación del microbioma para promover el vigor de los cultivos y la resistencia al estrés ambiental. El primer desafío es distinguir los miembros beneficiosos del microbioma vegetal de los miembros transitorios o comensales, reconociendo que algunos miembros que brindan beneficios al huésped probablemente cambien según la situación, ya sea durante el desarrollo de la planta o debido al estrés ambiental27,28,29, mientras que otros son estables30. ,31. El segundo desafío es que las plantas y sus agroecosistemas son temporalmente dinámicos durante la temporada de crecimiento, y su microbiota asociada también es dinámica. Actualmente no está claro qué funciones pueden estar asociadas con la dinámica microbiana de la filosfera y sus posibles interacciones con las plantas huéspedes.

Anteriormente, utilizamos el análisis de amplicones del gen 16S rRNA para identificar una cohorte "central" de taxones bacterianos y arqueales que estaban persistentemente asociados con los microbiomas de la filosfera de dos materias primas perennes para biocombustibles, miscanthus y switchgrass. La membresía persistente se estableció mediante la recolección de muestras de hojas en parcelas de campo replicadas, durante un ciclo estacional templado y durante dos temporadas de crecimiento anuales para el pasto varilla32. Otros estudios en pasto varilla han informado de manera similar que la hoja se puede distinguir de otros compartimentos de la planta por su composición de microbioma (p. ej., 33,34,35,36,37), lo que sugiere selección hacia el compartimento de la hoja. En el estudio actual, nuestro objetivo era comprender los atributos funcionales y las actividades de los taxones persistentes de la filosfera, con interés en adaptaciones especializadas de la hoja y las interacciones con la planta huésped que pueden informar los mecanismos y la naturaleza de las interacciones planta-microbio. Por lo tanto, realizamos un análisis estacional de los metagenomas de la filosfera para miscanthus y switchgrass utilizando ácidos nucleicos de las mismas muestras utilizadas para el análisis de amplicones. Emparejamos nuestra serie longitudinal de metagenomas con análisis de metatranscriptomas en momentos seleccionados en la fenología del pasto varilla para determinar qué funciones estaban activas estacionalmente. Realizamos análisis del metagenoma centrados en el genoma y nos centramos en comprender la dinámica estacional y las funciones de un subconjunto focal de genomas ensamblados en metagenoma (MAG) de calidad media y alta que pudimos agrupar a partir de estos datos. Nuestros resultados revelan funciones que respaldan un estilo de vida asociado a las hojas y actividades estacionales de los miembros persistentes de la filosfera. Finalmente, proporcionamos evidencia de que estos genomas fueron detectados en varios sitios y años más allá de nuestras parcelas de estudio originales, lo que sugiere que son habitantes generales y consistentes de pastos bioenergéticos del medio oeste de EE. UU.

Aquí, avanzamos desde nuestro perfil de microbioma anterior (con secuenciación del amplicón de ARNr 16S) para comprender la dinámica temporal del microbioma de la filosfera epífita de las materias primas para biocombustibles perennes miscanthus y switchgrass32 para ahora investigar los genes funcionales y las actividades estacionales de las poblaciones focales de la filosfera. En nuestro estudio anterior, identificamos miembros "centrales" de estos microbiomas en función de su persistencia y ocupación temporal. Aquí, reunimos genomas ensamblados con metagenomas para centrar el análisis en las poblaciones más persistentes y abundantes y su dinámica estacional, y luego reclutamos metatranscripciones para los MAG focales para comprender su dinámica de transcripción estacional para el pasto varilla. Primero informamos la superposición entre los dos conjuntos de datos diferentes en la detección de poblaciones "centrales" y "focales" y su taxonomía, luego pasamos a describir la dinámica estacional general de los MAG y su dinámica de transcripción estacional, y finalmente exploramos las vías consistentes detectadas y activadas. a través de MAG focales que pueden sugerir un estilo de vida asociado a las hojas y/o sensible al huésped. Además, buscamos estos MAG focales en otros metagenomas del medio oeste para comprender más sobre sus distribuciones.

Utilizamos un enfoque basado en MAG (a diferencia del aislamiento y la secuenciación del genoma en cada momento) por tres razones principales. En primer lugar y lo más importante, utilizamos un enfoque basado en MAG para poder capturar miembros aún no cultivables y consultar sus genes funcionales sin imponer sesgos de cultivo en nuestra comprensión del microbioma de la filosfera. En segundo lugar, queríamos lograr una coincidencia de las transcripciones observadas con genes funcionales del mismo conjunto de lisis celular y coextractos de ARN y ADN directamente emparejados. En tercer lugar, queríamos aprovechar el rendimiento de la secuenciación independiente del cultivo para lograr una resolución relativamente mayor en el tiempo y el espacio de lo que es posible dado el mismo costo y esfuerzo utilizando la secuenciación del genoma de aislados dependiente del cultivo.

Se recolectaron hojas de pasto varilla y miscanthus en el Centro de Investigación de Bioenergía de los Grandes Lagos (GLBRC) ubicado en la Estación Biológica Kellogg (KBS) en Hickory Corners, MI, EE. UU. (42o23'41.6” N, 85o22'23.1” W) (Fig. 1). . Tomamos muestras de pasto varilla (Panicum virgatum L. cultivar Cave-in-rock) y miscanthus (Miscanthus x giganteus) de los sitios del Experimento del Sistema de Cultivo de Biocombustibles (BCSE) (la parcela se replica 1–4, 32). Recolectamos hojas de pasto varilla y miscanthus a las ocho y nueve puntos temporales, respectivamente, en 2016 y pasto varilla en siete puntos temporales de la temporada de 2017 (Tabla 1, Fig. 1, Datos complementarios 1, Datos complementarios 2). De las superficies de las hojas, aislamos ácidos nucleicos para el análisis del metagenoma y el metatranscriptoma. (Fig. 2), que incluyó control de calidad y filtrado (Fig. S1, Tabla S1), ensamblaje, mapeo, anotación, agrupación del genoma y desreplicación (ver Métodos).

R El sitio de estudio está en la Estación Biológica Kellogg (KBS), un sitio de investigación ecológica a largo plazo centrado en agroecosistemas ubicados en el suroeste de Michigan. B Se tomaron muestras de cuatro bloques replicados al azar del sistema de cultivo del Experimento del sistema de cultivo de biocombustibles (BCSE) en cada momento para detectar pasto varilla (verde) y/o miscanthus (azul). Dentro de cada parcela, se muestrearon una parcela principal fertilizada y una subparcela no fertilizada. El relleno de símbolo C muestra qué secuenciación se realizó en muestras de qué puntos de tiempo y para qué cultivo. Los cuadrados rellenos muestran muestras que se recolectaron y los cuadrados abiertos muestran muestras que no se recolectaron en un momento determinado, con un cultivo en particular. En 2016, se tomaron muestras tanto de pasto varilla como de miscanthus, y en 2017 solo se tomaron muestras de pasto varilla. Las hojas de Switchgrass se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido para la extracción de ARN y el análisis del metatranscriptoma en un subconjunto de momentos en 2016 y en todos los momentos en 2017. En particular, los nuevos conjuntos de datos de metagenoma y metatranscriptoma presentados aquí se superponen con las muestras del tiempo del amplicón de ARNr 16S. serie presentada en Grady et al.32 y la serie temporal de amplicones ITS presentada en Bowsher et al.96.

Las lecturas de Switchgrass se muestran en verde claro y miscanthus en verde oscuro. La flecha gris sólida representa el paso de análisis común para ambos conjuntos de datos. La figura fue hecha con Lucidchart. Tenga en cuenta que los datos del metatranscriptoma provienen únicamente del pasto varilla y no del miscanthus.

Entre todos los MAG ensamblados (n = 238), centramos el análisis en 40 que eran de calidad alta y media según los estándares de integridad y contaminación (Fig. 3A, Datos complementarios 3)38. La detección consistente de estos 40 MAG en muestras tanto de miscanthus como de pasto varilla (Fig. 4) sugiere que sus poblaciones de origen no eran específicas del huésped sino que estaban distribuidas entre estos pastos perennes; esto respalda nuestros resultados anteriores del estudio de amplicones del gen 16S rRNA que reveló una superposición sustancial en los principales taxones de bacterias foliares en los dos cultivos32. Además, hubo 38 OTU "centrales" de nuestra encuesta anterior que también estaban asociadas con 25 MAG focales según sus identificaciones taxonómicas (Fig. 3B); Nuestro estudio anterior priorizó las OTU en función de la abundancia y la ocupación estacional y replicada en el campo, por lo que esto sugiere de manera conservadora que más de la mitad de las MAG focales representan los taxones más abundantes y consistentemente detectados en este ecosistema. Los 40 MAG focales representaron más a los órdenes Rhizobiales (n = 8/40), Actinomycetales (n = 6/40), Burkholderiales (n = 6/40) y Sphingomonadales (n = 6/40) (Datos complementarios 3).

Abundancia y ocupación de genomas ensamblados y agrupados a partir de metagenomas de filosfera de pasto varilla y miscanthus. La evaluación de la calidad y la contaminación se determinó mediante checkM. Se seleccionaron 40 MAG focales. La ocupación es la proporción de los 192 metagenomas en los que se detectó un MAG, y la abundancia es el promedio normalizado por la cobertura MAG del gen de mantenimiento (HKG) en los 192 metagenomas. El tamaño del símbolo muestra el porcentaje de integridad del MAG y el color muestra el porcentaje de contaminación, mientras que los colores más fríos indican una menor contaminación. B Taxonomía de MAG focales, según lo anotado con GTDB-tk, y superposición taxonómica con los taxones persistentes detectados en nuestra encuesta anterior de amplicones del gen 16S rRNA, que se realizó en las mismas muestras y series de tiempo. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

La abundancia se indica mediante la intensidad del color: el azul indica abundancia alta y el blanco indica abundancia baja. Abundancias MAG para: metagenomas de A Miscanthus 2016 (metaG); B metagenomas de Switchgrass 2016; C metagenomas de Switchgrass 2017; Metatranscriptomas D Switchgrass 2016 (metaT) y metatranscriptomas E Switchgrass 2017. Las abundancias de contigs del metagenoma se estimaron con el par de bases mediano del reclutamiento de lectura dividido por la cobertura promedio del par de bases mediano de los genes de mantenimiento. Las abundancias de ORF del metatranscriptoma se estimaron en función de la cobertura mediana de pares de bases de todas las lecturas asignadas a ORF y se dividieron por la cobertura mediana de pares de bases de los genes de mantenimiento. Se aplica el mismo dendrograma a todos los paneles, y es el resultado de la agrupación jerárquica (ver Fig. S2) de la diversidad y abundancia de metatranscriptomas en el pasto varilla. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Los MAG focales exhibieron patrones estacionales variados en su reclutamiento de lectura general tanto para el metagenoma (Fig. 4A – C) como para el metatranscriptoma (Figs. 4D, E, S2), observándose una detección estacional temprana, tardía y consistente. Sin embargo, en los metatranscriptomas de ambos años (para pasto varilla), hubo un enriquecimiento estacional general de subsistemas KEGG particulares representados por las transcripciones a lo largo del tiempo, con aumentos en los últimos meses de muestreo (Fig. S3). La comparación de las abundancias acumuladas de transcripciones de cada MAG entre las fechas de muestreo de principios (mayo – junio) y finales (julio – septiembre) de 2017 mostró aumentos significativos en la transcripción en 38 de 40 MAG y una disminución de la transcripción en 1 MAG (S28) (Kruskal de dos caras). -Test de Wallis basado en distribución chi-cuadrado, valor p <0,05). Fenológicamente, las muestras de agosto correspondieron con un pico (tardío) de biomasa y fructificación para pasto varilla y con un dosel cerrado tanto para pasto varilla como para miscanthus. La senescencia ocurrió a mediados de septiembre para el pasto varilla y hasta noviembre para el miscanthus. En particular, el reclutamiento de lectura de metatranscriptoma en los MAG fue sólido incluso cuando hubo una detección inconsistente en el reclutamiento de lectura de metagenoma (Fig. 4), lo que sugiere que estos MAG estaban consistentemente activos y tenían una actividad relativamente alta incluso cuando la detección de su genoma estaba oscurecida.

Los MAG se agruparon según la coherencia en la dinámica de transcripción estacional (Figs. 4D, E, S2). Se identificaron cinco grupos (grupos) coherentes y estadísticamente respaldados de 40 MAG (Fig. S2). El grupo 1 contenía un único MAG S28, asignado al género Pseudomonas (S28, 98 % completo, 1,9 % de contaminación, 98,8 % de identidad promedio de nucleótidos con P. ceresai GCA_900074915.1)39 y sus genes se enriquecieron a principios de la temporada (2017). pero el MAG estuvo activo durante toda la temporada. Los otros cuatro grupos contenían numerosos MAG y eran relativamente más dinámicos, con tendencias hacia el enriquecimiento tardío de las transcripciones. Varios grupos contenían MAG anotados en la misma clase, lo que sugiere coherencia taxonómica en actividades estacionales. Por ejemplo, el grupo 3 incluía todos menos uno (de ocho) MAG de Actinomycetia.

No es sorprendente que los subsistemas más abundantes identificados entre los 40 MAG focales estuvieran asociados con el crecimiento bacteriano, como los metabolismos de carbohidratos, energía, aminoácidos y nucleótidos (Fig. 5). Los metatranscriptomas de las hojas también mostraron que la mayoría de las transcripciones de los subsistemas se enriquecieron constantemente durante la temporada (15/21 subsistemas aumentaron significativamente; valor de p <0,05, Tabla S2). La mayoría de las transcripciones aumentaron a lo largo de la temporada, con algunas excepciones, incluidas las asociadas con la colonización. Una investigación más detallada de las funciones que tendieron a disminuir durante la temporada reveló que podrían atribuirse casi exclusivamente a MAG S28 (el único miembro en el grupo 1 y más estrechamente asociado con Pseudomodales, Figs. S3 y S4). Finalmente, algunas clasificaciones KEGG fueron relativamente estables y carecieron de tendencias estacionales significativas en general, incluidas transcripciones de motilidad celular, resistencia a los antimicrobianos, adaptación, transducción de señales y traducción.

El eje y se escala para cada clasificación. Los tamaños de muestra se proporcionan en la Tabla 1 e incluyeron 22 y 56 metatranscriptomas para pasto varilla en 2016 y 2017, respectivamente. Los datos se presentan como valores medios +/− error estándar de la media. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Se identificaron un total de 124 roles funcionales distintos en al menos 39 de los 40 MAG (Fig. S5). Estas funciones funcionales fueron generalmente amplias y asociadas con la traducción (n = 48/124), el metabolismo de la energía (n = 29/124) y el metabolismo de los carbohidratos (n = 28/124). También hubo varios roles funcionales asociados con los cofactores y las vitaminas (n = 18/124). Si bien muchas funciones se enriquecieron en las transcripciones al final de la temporada (julio-septiembre) en relación con la temporada (mayo-junio), tres roles funcionales, en particular, se destacaron con enriquecimientos superiores a 20 veces en las transcripciones del final de la temporada. Estas tres funciones funcionales incluían proteínas clasificadas como deshidrogenasa de cadena corta, molibdopterina oxidorreductasa y policétido ciclasa (Tabla 2, Fig. S5).

Luego realizamos análisis de vías genéticas metabólicas, biosintéticas y asociadas a plantas para comprender las funciones detectadas entre los MAG focales en la filosfera y sus actividades inferidas por el reclutamiento de transcripciones en las vías (Fig. 6). Nuestra hipótesis es que algunas de las vías compartidas entre poblaciones bacterianas pueden representar funciones de aptitud física en la hoja. Vías para el metabolismo de los terpenos (34/40), la biosíntesis de betaína (30/40), el metabolismo de la trehalosa (25/40), la degradación del cianuro (21/40), la degradación de las ROS (23/40) y la degradación del ácido indolacético (IAA). (40/40) fueron las vías más comunes compartidas y activas entre los MAG y se encontraron en linajes de las cuatro clases representadas por los MAG focales. Por lo tanto, es probable que estas vías sean comunes entre los miembros de la filosfera y respalden en gran medida un estilo de vida asociado a las hojas. Además, hubo algunas vías y actividades funcionales que pueden ser funciones más especializadas porque se detectaron sólo en unos pocos MAG (p. ej., metabolismo del xilitol). Sin embargo, no había un patrón filogenético claro en la distribución de estas supuestas funciones especializadas.

Las vías de genes funcionales se seleccionaron utilizando antiSMASH para grupos de genes biosintéticos, gapseq para vías metabólicas generales y selección manual para funciones asociativas de plantas informadas en la literatura. Las vías que se descubrieron en los MAG pero no se detectaron en las transcripciones se representan mediante círculos abiertos, y las vías detectadas en los MAG y mapeadas por las transcripciones se representan mediante círculos rellenos. Los colores categorizan diferentes grupos funcionales de vías. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Debido a la detección casi ubicua de genes biosintéticos relacionados con terpenos en los MAG focales, examinamos sus anotaciones y reclutamiento más de cerca utilizando predicciones de la función genética (es decir, ORF), lo que se esperaba que mejorara la sensibilidad de la anotación funcional en relación con la vía metabólica. herramientas (por ejemplo, BGC). Detectamos 278 ORF asociados con anotaciones de terpenos en las metatranscripciones. En conjunto, estos genes relacionados con los terpenos siguieron la tendencia de enriquecimiento gradual a lo largo de la temporada (Fig. 7A) y fueron relativamente abundantes en ambos años. La subcategoría de mayor enriquecimiento fue la biosíntesis de la columna vertebral de terpenoides, que incluía 29 ORF. Entre varios genes de biosíntesis de isopreno detectados, fue de interés el enriquecimiento relativamente alto y estacional de las dos enzimas terminales en la vía de biosíntesis de isopreno sin mevalonato que emplean las bacterias, gcpE y lytB (Figs. 7B y S6). Se detectaron transcripciones de los genes GcpE y lytB en más de un tercio de los MAG (13/40), y estos incluían MAG que representaban los tres filos detectados. Seis de las ocho proteobacterias que reclutaron transcripciones de biosíntesis de isopreno fueron anotadas en Mmethylobacterium (alfa). Los cuatro Actinomycetia estaban más distribuidos filogenéticamente y anotados como géneros Frigoribacterium M1, Microbacterium M105, Amnibacterium M67 y Pseudokineococcus M86. El único Bacteroidota que tenía transcripciones de biosíntesis de isopreno fue un Hymenobacter M9. Luego investigamos los 40 MAG para detectar cualquiera de los nueve genes previamente informados que estaban involucrados en la biosíntesis bacteriana de isopentenil difosfato, un precursor de terpenoides como el isopreno40 y descubrimos que 29/40 MAG tenían seis o más de los genes detectados y que todos Los MAG tenían al menos 2 de los genes (Tabla S3). La detección consistente de genes asociados con las vías del isopreno en estos MAG, que están completos >50%, sugiere que la biosíntesis de moléculas relacionadas con el isopreno puede ser una estrategia foliar prominente por parte de las bacterias de la filosfera. Pseudomonas MAG S28, que anteriormente se señaló como la población dominante que colonizó y activó a principios de la temporada (Figs. 4 y S2), tuvo un alto enriquecimiento de transcripción de biosíntesis de isopreno a principios de la temporada que luego disminuyó. Sin embargo, los otros once MAG que albergan genes de las vías de biosíntesis de isopreno tuvieron una mayor actividad al final de la temporada.

Una dinámica de transcripción de hojas de pasto varilla de 2016 (verde, círculo) y 2017 (azul, triángulo) de las clasificaciones del metabolismo KEGG asociadas con el metabolismo de los terpenos. B Transcripciones en MAG asociadas con enzimas terminales en la biosíntesis de isopreno no mevalonato, gcpE y lytB. Los MAG ID incluyen taxonomía prevista a nivel de género: Mmethyl = Mmethylobacterium, Frigor = Frigoribacterium, Pseudokineo = Pseudokineococcus, Microbac = Microbacterium, Amnibac = Amnibacterium, Hymeno = Hymenobacter, Sphingo = Sphingomonas y Pseudo = Pseudomonas. Los tamaños de muestra se proporcionan en la Tabla 1 e incluyeron 22 y 56 metatranscriptomas para pasto varilla en 2016 (círculos verdes) y 2017 (triángulos azules), respectivamente. Los datos se presentan como valores medios ± error estándar de la media. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Volviendo a las anotaciones de BGC (por antiSMASH, Fig. 6), la mayoría de las transcripciones de terpenos descubiertas mediante este enfoque se asociaron con la biosíntesis de pigmentos (p. ej., carotenoides). La segunda clase más consistente de transcripciones de BGC en los MAG focales fueron los genes de la péptido sintasa no ribosomal (NRPK), pero la mayoría de ellos no tenían anotaciones adicionales más allá de la categoría general. Por lo tanto, el análisis ORF y la detección de BGC tuvieron resultados complementarios, especialmente para las funciones relacionadas con terpenos e isopreno. Otro hallazgo notable de BGC fue que todos menos dos (de ocho) Actinomycetia MAG tenían transcripciones para policétido sintasas de tipo III, mientras que esta clase de BGC se detectó con menos frecuencia entre Proteobacteria y Bacteroidota.

Luego preguntamos si estos MAG focales se detectaron de manera más amplia en otros metagenomas de cultivos. Debido a que los metagenomas de las hojas no estaban disponibles, obtuvimos metagenomas del suelo relacionados de los sistemas de cultivo locales en Michigan y también de los datos disponibles públicamente dentro de la base de datos Integrated Microbial Genomes (IMG), que sirve como depósito para los esfuerzos de secuenciación del Joint Genome Institute en los EE. UU. Departamento de Energía. Nos sorprendió descubrir que, para cada metagenoma investigado, las lecturas podían asignarse a este conjunto de MAG. Esto incluyó metagenomas del suelo de campos de pasto varilla y miscanthus en tres ubicaciones (Iowa, Michigan y Wisconsin) y se tomaron muestras en cinco años diferentes (Fig. 8). Estos resultados sugieren que los MAG detectados y analizados pueden distribuirse ampliamente en los agroecosistemas del medio oeste y ser potencialmente de importancia general para entornos de cultivos perennes.

El tamaño de la muestra fue de 55 metagenomas públicos. Los datos se presentan como valores medios ± error estándar de la media. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Aquí, informamos una evaluación estacional de metagenoma y metatranscriptoma de varios años de la filosfera de las plantas en condiciones de campo agrícola, centrándonos en las funciones bacterianas asociadas con dos materias primas prometedoras para biocombustibles. Esperamos que estos hallazgos tengan relevancia para otros pastos o sistemas con biomasa aérea sustancial, incluidas las praderas nativas. Además, nuestra colección de MAG incluyó miembros de la filosfera previamente reportados como abundantes, persistentes o significativos para el ensamblaje del microbioma en otras plantas, incluido el modelo Arabidopsis (p. ej.,41, específicamente: Sphingomonadales, Pseudomonadales, Actinomycetales, Burkholderiales y Rhizobiales. Por lo tanto, el Los patrones y las funciones detectadas constantemente en esta colección seleccionada ofrecen información general, así como funciones estacionales de la filosfera.

Existen múltiples líneas de evidencia de que los MAG focales discutidos aquí representan linajes ecológicamente importantes en la filosfera del pasto varilla y miscanthus. En primer lugar, existe una amplia superposición entre estos MAG focales y los taxones centrales de alta abundancia y ocupación de nuestro análisis anterior del amplicón del gen 16S rRNA de la diversidad de la filosfera de switchgrass y miscanthus32, incluido un MAG asociado con Hymenobacter M9, que es un género que tenía alta ocupación en todos los campos y a lo largo del tiempo, así como varias OTU asignadas. Esta misma serie temporal se investigó en nuestro análisis de amplicones anterior, y los taxones principales se priorizaron utilizando la coherencia entre campos replicados en el mismo momento, la persistencia en el tiempo y la abundancia relativa. Esto sugiere que las poblaciones representadas por los MAG no son taxones raros que son transitorios en el sistema. En segundo lugar, pudimos generar ensamblajes de calidad a partir de datos complejos del metagenoma, que es un proceso que generalmente está sesgado hacia miembros abundantes. Estos MAG están altamente representados en abundancia de lecturas en metagenomas y también reclutaron relativamente más lecturas de metatranscriptomas, lo que sugiere que son abundantes y activos en la filosfera. Aunque es posible que falten linajes adicionales y ecológicamente importantes en nuestra colección, estamos seguros de que los discutidos aquí se encuentran entre las principales poblaciones seleccionadas por el huésped o el ambiente que habitan la filosfera de pasto varilla y miscanthus.

La trehalosa es un disacárido que protege las células contra el estrés por sal, agua y osmolitos al actuar como chaperona química estabilizadora, ya sea desplazando el agua de las superficies de las proteínas o vitrificando alrededor de las estructuras de las proteínas para protegerlas42. De manera similar, la betaína es otro osmoprotector comúnmente biosintetizado que utilizan los microorganismos para combatir el estrés hídrico, salino y térmico43. Se ha planteado la hipótesis de que ambas son importantes estrategias de supervivencia de los microorganismos en la filosfera, con evidencia que lo respalda a partir de análisis de genoma aislado44. Aquí, mostramos que tanto la trehalosa como la betaína son prominentes entre las poblaciones de MAG y se activan consistentemente en la superficie de la hoja, lo que sugiere que no se activan estacionalmente sino que son necesarias para el estilo de vida asociado a las hojas.

En las bacterias, el metabolismo de la trehalosa previene el metabolismo de desbordamiento celular y el estrés de carbono al redirigir la conversión de glucosa-6-fosfato a piruvato42. La biosíntesis de trehalosa es común entre bacterias y arqueas que viven en ambientes áridos, salinos, térmicos o estacionalmente secos (p. ej.,45,46,47) y también se ha informado que es inducida en una pseudomona por etanol48, que puede originarse dentro de la planta. células49 o más generalmente en las raíces (p. ej.,50), especialmente durante el estrés, la maduración del fruto o la senescencia51. En el pasto varilla y en las plantas en general, la concentración de trehalosa aumenta en respuesta a las condiciones de sequía52, y su precursor, la trehalosa-6-fosfato, induce la senescencia cuando el carbono está fácilmente disponible53. Además, se informó que Sphingomonas melonis, miembro de la filosfera de A. thaliana, regula la biosíntesis de trehalosa durante condiciones de crecimiento que promueven un estrés leve54. Teniendo esto en cuenta, tiene sentido que la mayoría de los MAG tuvieran enriquecimiento de transcripciones relacionadas con el metabolismo de la trehalosa, lo que respaldaría un estilo de vida asociado a las plantas durante la sequía y la senescencia del huésped54.

La biosíntesis de betaína en bacterias a menudo comienza con la oxidación de la colina, que forma parte de los tejidos vegetales y puede transportarse al interior de la célula55. De hecho, aquí se detectó degradación de colina en 9/10 MAG de gammaproteobacterias (Fig. 6). Se han sugerido osmolitos derivados de microbios, como la betaína y la trehalosa, como objetivos para el desarrollo de biotecnología para apoyar la tolerancia al estrés de los cultivos. Sin embargo, las plantas pueden biosintetizar betaína y pueden dividirse en grupos de aquellas que la acumulan y las que no la acumulan en concentraciones que apoyan la tolerancia al estrés56. Por ejemplo, en el pasto varilla, la concentración de glicina betaína no predijo las diferencias en la tolerancia a la sequía entre los diferentes genotipos, mientras que la trehalosa sí lo fue, junto con el ácido abscísico, la espermina y la fructosa52. Además, nuestros datos no sugieren limitaciones microbianas notables en el potencial genético o la activación de la biosíntesis de betaína en la filosfera.

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) sirven como señales para diversos procesos celulares y de desarrollo en las plantas, y aquí detectamos vías activas para la degradación de ROS en la mayoría de los MAG focales. Aunque los mecanismos precisos no están claros, se espera que la homeostasis de ROS esté involucrada en la senescencia57, lo cual es relevante para nuestro estudio dado que al menos entre algunas y la mayoría de las plantas senescentes se observaron por parcela en las fechas de muestreo de agosto y septiembre, respectivamente. Además, las ROS se acumulan en plantas que están expuestas a estrés abiótico, a efectos negativos. La degradación de ROS es una de las muchas funciones que emplean los microorganismos de la filosfera para hacer frente a las fluctuaciones esperadas de ROS en la superficie de la hoja (aunque estos flujos son difíciles de medir57). Anteriormente, varios genes relevantes para la respuesta al estrés oxidativo estaban regulados diferencialmente en una bacteria de la filosfera de tipo salvaje, Sphingomonas melonis, cepa Fr1, en comparación con un mutante knock-out para la regulación de la respuesta al estrés general cuando ambos se cultivaban en un medio que se esperaba que indujera niveles bajos de estrés oxidativo. estrés54. Dado que el manejo de las ROS de las plantas es un objetivo para reducir el estrés de los cultivos y regular el desarrollo de las plantas57,58, es posible que la manipulación de la degradación microbiana de las ROS pueda aplicarse como una herramienta para lograr tales esfuerzos, pero se necesita mucha más investigación para comprender la relación microbiana-huésped. interacción dada la exposición o acumulación de ROS, y cualquier posible señalización de ROS entre ellos.

La IAA es una fitohormona producida por las plantas para regular muchos procesos de crecimiento y respuesta al estrés (p. ej., 59, 60). También lo producen muchos microorganismos, incluidos aquellos que se ha demostrado que apoyan la promoción del crecimiento de las plantas (p. ej., 60). Por lo tanto, se espera la actividad de las vías de degradación de IAA por parte de MAG focales, dadas las redundancias entre plantas y microorganismos en la síntesis y respuesta a IAA, y demuestra la capacidad de respuesta del microbioma a la retroalimentación en el entorno del huésped.

La mayoría de las funciones identificadas en nuestros MAG sugieren requisitos generales para el crecimiento y mantenimiento dado un estilo de vida asociado a las hojas (por ejemplo, metabolismo de carbohidratos y aminoácidos, producción de pigmentos para proteger de la radiación, similar a informes anteriores, por ejemplo,61. Sin embargo, el análisis de BGC "Reveló una consistencia sorprendente en las vías del metabolismo de los terpenos, lo que nos llevó a observar más de cerca los ORF de transcripción asociados con los terpenos. Este análisis reveló un enriquecimiento particular en las vías y genes asociados con la biosíntesis de isoprenoides. Los isoprenoides son una clase de terpenos volátiles que generalmente son abundantes y reactivos, y participan en una retroalimentación indirecta y compleja con metano y gases de efecto invernadero de óxido nitroso 62. El isopreno es uno de los isoprenoides más simples. Es liberado por muchas especies de plantas y gran parte de él se sintetiza dentro de la vía del fosfato de metileritritol del cloroplasto (MEP, también conocido como: no mevalonato) 63. Se cree que el isopreno actúa como una molécula de señalización en la respuesta al estrés 64. Los estudios también han encontrado que la emisión de isopreno protege la fotosíntesis de las hojas contra episodios cortos de altas temperaturas 65. Las plantas emiten isopreno a partir de hojas maduras y fotosintéticamente activas, y las emisiones responden a la luz63. Sin embargo, se ha informado que las hojas senescentes disminuyen sus emisiones de isopreno en relación con sus hojas en su máximo crecimiento66. Se ha informado que tanto el pasto varilla como el miscanthus emiten niveles basales relativamente bajos de isopreno67,68.

Especulamos que los miembros de la comunidad bacteriana de la filosfera, materia prima de los biocombustibles, pueden estar compensando la pérdida de isopreno de origen vegetal, participando en la señalización de isoprenoides entre especies con el huésped, protegiendo la fotosíntesis de las plantas del daño térmico, extinguiendo las especies reactivas de oxígeno o posiblemente produciendo isoprenoides como metabolitos de desbordamiento (como se plantea la hipótesis para Bacillus subtilus69). Los degradadores y sintetizadores de isopreno bacterianos están muy extendidos en la naturaleza62 y han sido investigados previamente en comunidades de la filosfera del relativamente alto emisor de isopreno Populus spp70, así como en suelos71, que pueden servir como sumidero de isopreno. Se han utilizado ensayos de isótopos estables para determinar que un subconjunto de miembros de la comunidad de bacterias degradan el isopreno, incluidas varias Actinobacteria (Rhodococcus spp.) y Variovorax (Proteobacteria)70,71. Nuestra colección MAG contiene varios Actinomycetia, un Hymenobacter, varios Mmethylobacterium y Pseudomonas MAG S28 que muestran la activación de genes involucrados en la biosíntesis de isoprenoides y respaldan su participación en retroalimentaciones moleculares relacionadas en la filosfera. Además, como estas actividades se detectaron en tres filos de Bacteria, sugiere que la biosíntesis de moléculas relacionadas con el isopreno puede ser una función muy común del microbioma de la filosfera. Como el isopreno es un precursor de las cadenas laterales necesarias para varias quinonas72, se podría especular que las bacterias de las hojas eliminan el isopreno emitido por la planta huésped para complementar la síntesis bacteriana de estas cadenas laterales, pero luego lo compensan con una biosíntesis de novo si el huésped disminuye la producción. Observamos que la síntesis de isoprenoides aumenta estacionalmente en la mayoría de los MAG que contienen estas vías y al mismo tiempo que se espera que las emisiones de isopreno de las plantas también disminuyan, y dirige el trabajo futuro para comprender estas dinámicas y la posible interacción bacteria-huésped mediada por isoprenoides.

Destacamos tres poblaciones MAG que fueron de interés por su taxonomía, funciones, dinámica u ocupación. Todos fueron compartidos con taxones en nuestra encuesta anterior de ARNr 16S, lo que respalda su inclusión como parte del conjunto "básico" que fue seleccionado por abundancia y ocupación. Primero, MAG S28 de alta calidad (>97% completo, <2% de contaminación) fue un destacado pionero y colonizador activo de la hoja (Fig. 4, S2 Grupo 1). MAG S28 está relacionado con Pseudomonas cerasi, una especie que tiene parientes fitopatógenos73, pero no notamos ningún síntoma de enfermedad en las hojas analizadas. Esta población había esperado rasgos de un colonizador de superficie fuerte, incluidos los subsistemas de colonización, adaptación y motilidad. También tenía seis vías relacionadas con respuestas de fitohormonas (de un total de 7 vías de fitohormonas observadas en estos datos), incluida la biosíntesis de eteno activado, ACC desaminasa y degradación de etilenglicol, putrescina, salicilato e IAA. Estos datos sugieren que S28 tiene varios mecanismos para interactuar o responder al huésped a través de fitohormonas.

A continuación, MAG M9, identificado como Hymenobacter, fue de interés porque estaba asociado con el grupo taxonómico más numeroso detectado en nuestro estudio previo del gen 16S rRNA y no entre los linajes de filosfera más típicamente investigados en la literatura. Si bien las poblaciones de M9 se detectaron por primera vez a principios de la temporada, sus transcripciones se enriquecieron al final de la temporada (Figs. 4 y S2 Grupo 5). MAG M9 había detectado y activado los metabolismos de galactonato, N-acetilglucosamima y lactosa, que no eran comunes entre los MAG focales. También tenía degradación activada de benzoato, curcumina y putrescina, así como desintoxicación de cianuro, secreción tipo VI y oxidación de dihidrógeno. Si bien M9 también tenía algunas vías que eran comunes entre estos MAG (por ejemplo, degradación de ROS e IAA, biosíntesis de terpenos), su conjunto de vías y funciones menos detectadas sugiere un papel especializado en la comunidad de la filosfera. En particular, M9 tiene un 65 % de finalización y un 0 % de contaminación detectada, lo que sugiere que aún queda por descubrir más potencial funcional para este y otros linajes similares de Hymenobacter que habitan la filosfera.

Finalmente, seleccionamos un Actinomycetia MAG M60 representativo, un linaje Quadrisphaera que había activado la biosíntesis de isoprenoides y había aumentado su actividad al final de la temporada, junto con la mayoría de los MAG focales (Figs. 4 y S2 Grupo 3). Los estudios han encontrado que los miembros de Actinomycetia son una parte importante de la filosfera que contribuye a la prevención de enfermedades y al crecimiento de las plantas74,75,76. MAG M60 tenía varios metabolismos de oligo/polisacáridos que con poca frecuencia se detectaron en estos datos, incluidos glucógeno, melibiosa y trehalosa. A pesar de su alta integridad y baja contaminación (>95% y <5%, respectivamente), M60 fue escasamente anotado por los métodos que aplicamos. Sin embargo, se ha informado que los taxones de Quadrisphaera son muy abundantes en la filosfera o endosfera de varias plantas77.

Muchas revisiones, perspectivas y artículos de opinión recientes han instado a la integración de enfoques multiómicos para mejorar la comprensión del microbioma y su relación con la planta huésped44,78,79,80,81. Sin embargo, la mayoría de los estudios integradores se han centrado casi exclusivamente en la rizosfera como el compartimento de retroalimentación suelo-planta y de adquisición de nutrientes y agua para el huésped. Aunque las hojas son fácilmente accesibles para el muestreo, el microbioma de la filosfera es un desafío para investigar utilizando enfoques de rendimiento independientes del cultivo, como la metagenómica y la metatranscriptómica. Hay altos niveles de contaminación del huésped y del cloroplasto en las muestras de hojas, y una biomasa microbiana por hoja relativamente baja que primero debe ser desalojada de las biopelículas fuertemente adheridas. Una señal del ARN mensajero en el análisis del metatranscriptoma está enmascarada por una abundante señal de ARN ribosomal, lo que genera mayores desafíos. Estos dos desafíos dan como resultado una proporción relativamente baja de secuencias utilizables en relación con el esfuerzo total de secuenciación (después del filtrado de calidad de la señal no objetivo) para estudios de microbioma foliar, lo que también fue cierto en este trabajo y es una limitación del mismo. Debido a la combinación de todos estos desafíos, gran parte de nuestra comprensión de la filosfera, como la superficie más grande de habitación microbiana en la Tierra26, se ha aprendido de estudios que emplean huéspedes modelo y comunidades microbianas sintéticas o modelo en entornos controlados, o de Descripción de la estructura de la comunidad mediante la secuenciación de genes marcadores, amplificados y desprovistos bioinformáticamente de genes de cloroplastos para superar los desafíos de la baja señal y la contaminación del huésped.

Aquí, informamos protocolos de laboratorio optimizados (para minimizar las señales del huésped y del cloroplasto) combinados con un enfoque bioinformático centrado en el genoma para realizar análisis funcionales enfocados de genes y transcripciones de miembros del microbioma de la filosfera estacionalmente dinámicos pero persistentes. Nuestro trabajo es un trabajo metatranscriptómico bacteriano no dirigido realizado en la filosfera foliar de cultivos cultivados en el campo. Otros estudios recientes de metatranscriptomas foliares se han centrado en las comunidades virales de tomate y pimiento82, soja83 y arroz84. Una fortaleza clave de este trabajo es la desafiante integración de los datos del metagenoma y el metatranscriptoma de la filosfera, aprovechando la mayor cobertura de los metagenomas con la información de actividad disponible en los metatranscriptomas. A pesar de la cobertura relativamente limitada de los MAG (debido a una contaminación sustancial del ADN ribosómico y del huésped), el análisis resultó exitoso al integrar ambos conjuntos de datos y centrarse en la interpretación centrada en el genoma. Por lo tanto, es probable que existan muchas más poblaciones prevalentes y funcionalmente activas de la filosfera que no fueron capturadas en este estudio, incluidos aquellos actores que se sabe que son clave en la filosfera (por ejemplo, 20, 85). Un esfuerzo adicional sustancial de secuenciación o una estrategia de enriquecimiento mejoraría la señal para que un enfoque independiente del cultivo se dirija a esos actores. Si bien el uso de enfoques centrados en el genoma tiene la desventaja obvia de que obviamente no hemos capturado a todos los miembros del microbioma, nuestro enfoque nos permite vincular funciones transcritas activamente con miembros microbianos específicos. Además, los genes funcionales y las actividades documentadas aquí son lógicas dada la comprensión actual de la adaptación microbiana al entorno del huésped y la filosfera.

En general, este trabajo proporciona evidencia de un microbioma próspero, dinámico, funcionalmente diverso, especializado en hojas y sensible al huésped en la filosfera de los pastos perennes. Proporciona evidencia de funciones específicas de la filosfera que se activan estacionalmente en un agroecosistema templado y sugiere varias hipótesis de importantes interacciones entre el huésped y el microbio en la filosfera, por ejemplo a través del metabolismo central, la biosíntesis de isoprenoides y la respuesta al estrés. Esta investigación contribuye a nuestra amplia comprensión de la dinámica y las actividades de las comunidades microbianas de la filosfera y señala funciones microbianas específicas a las que apuntar y que podrían resultar útiles para la gestión del microbioma de las plantas.

Las hojas de pasto varilla y miscanthus y los datos contextuales correspondientes se recolectaron en el Centro de Investigación de Bioenergía de los Grandes Lagos (GLBRC) ubicado en la Estación Biológica Kellogg (KBS) en Hickory Corners, MI, EE. UU. (42o23'41.6” N, 85o22'23.1” W). en los sitios del Experimento del Sistema de Cultivo de Biocombustibles (BCSE) del GLBRC, dentro de la parcela se replican 1 a 4 de acuerdo con el protocolo del sitio, lo que implicó caminar a lo largo de un transecto y detenerse en estaciones de muestreo predeterminadas situadas al azar dentro de los campos para alterar mínimamente el cultivo. (Figura 1). Tomamos muestras de pasto varilla (Panicum virgatum L. cultivar Cave-in-rock) y miscanthus (Miscanthus x giganteus) recolectando hojas en ocho y nueve momentos, respectivamente, en 2016 y para pasto varilla en siete momentos en la temporada 2017 (Tabla 1). , Fig. 1, Datos complementarios 1, Datos complementarios 2). Recolectamos hojas para el aislamiento de ARN en tres momentos de tiempo de pasto varilla informados por la fenología en 2016 (emergencia, crecimiento máximo y senescencia) de acuerdo con los métodos de fenología estándar del GLBRC [https://data.sustainability.glbrc.org/protocols/165] para evaluar el potencial para una extracción de ARN de suficiente masa y calidad de la superficie de la hoja de pasto varilla, y luego se amplió para incluir hojas de todos los puntos temporales de muestreo de pasto varilla en 2017. Las hojas para el aislamiento de ARN se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido inmediatamente y se almacenaron a -80 oC hasta su procesamiento.

Se aisló y procesó ADN de epífitas de la filosfera32. Para este estudio se utilizaron las mismas muestras de filosfera y ácidos nucleicos extraídos que para Grady et al. 2019 (análisis del amplicón de ARNr 16S) y para Bowsher et al. 2020 (análisis de amplicones ITS). Las concentraciones de ADN se normalizaron a 4 ng/ul. El ARN epífito de la filosfera se aisló utilizando un líquido de cloruro de bencilo: extracción líquida, basada en 32 que fue modificada recientemente para el aislamiento de ARN según los métodos publicados de 86. Se agregaron aproximadamente 5 g de material foliar intacto y congelado a un tubo cónico de polipropileno de 50 ml (Corning #430290) y se mantuvieron congelados en nitrógeno líquido mientras se pesaban y transferían las muestras. La solución desnaturalizante (DS) se preparó con tiocianato de guanidina 4,2 M, citrato de sodio dihidrato 25 mM, pH 7,0, n-lauroil sarcosina sódica al 0,5 % (v/v) en agua Milli-q y se esterilizó por filtración a través de filtros de 0,22 mm. Inmediatamente antes de la extracción, se preparó una solución madre de trabajo de DS nueva añadiendo 2-mercaptoetanol hasta una concentración final del 5 % (v/v, DS/2-ME). A cada tubo de hoja se añadieron 5 ml de cloruro de bencilo, 2,5 ml de acetato de sodio 3 M (pH 5,2) y 5 ml de la solución madre de trabajo de DS/2-ME. El tubo se incubó en un baño de agua a 60 oC durante 20 min con agitación cada 1 min. Las hojas se retiraron del tubo cónico utilizando unas pinzas esterilizadas con etanol y se desecharon.

Se agregaron cinco ml de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1) a la solución restante en cada tubo cónico, que luego se agitó manualmente durante 15 segundos y se incubó en hielo durante 15 minutos. Luego, los tubos se centrifugaron a 12.000 x g durante 15 minutos a 4 ° C para separar las fases acuosa y orgánica. Se transfirieron hasta 5 ml de la fase acuosa superior a un tubo de polipropileno limpio de 15 ml sin alterar la interfaz blanca. Se agregaron dos ml y medio de tampón citrato de sodio (cloruro de sodio 1,2 M, citrato de sodio dihidrato 0,8 M en agua Milli-q, esterilizado por filtración a 0,22 mm) e isopropanol enfriado con hielo para lograr un volumen final de 12,5 ml. A continuación, los tubos se centrifugaron a 12.000 x g durante 15 minutos para sedimentar el ARN y el sobrenadante restante se aspiró con una pipeta. Los sedimentos de ARN se resuspendieron en 0,3 ml de solución de trabajo DS/2-ME y luego se agregaron 0,3 ml de isopropanol enfriado con hielo y se mezclaron pipeteando suavemente. La solución se incubó durante 30 minutos a -20 °C y luego se transfirió el volumen completo a un tubo limpio sin nucleasas de 1,7 ml y se centrifugó a 16.000 x g durante 15 minutos a 4 °C. Se eliminó el sobrenadante y el sedimento se lavó en 1 ml de etanol al 75% libre de nucleasas. Luego, los tubos se centrifugaron a 16.000 xg durante 15 minutos a 4 °C y el sobrenadante se eliminó nuevamente con una pipeta. El sedimento restante se secó al aire para eliminar completamente el etanol residual y luego se resuspendió en 30 ml de tampón Tris-EDTA libre de nucleasa, pH 8,0.

El ADN genómico (ADNg) se eliminó utilizando ADNasa I libre de ARNasa (Thermo Fisher #AM2222) según las instrucciones del fabricante. Luego, el ARN se purificó utilizando el kit de limpieza RNeasy MinElute (Qiagen Germantown, MD, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La ausencia de ADNg contaminante se confirmó por la falta de amplificación de la región V4 del gen 16S rRNA mediante PCR87 con controles positivos y negativos. Este método de aislamiento de ARN se desarrolló para alinearse más estrechamente con nuestro aislamiento de ADN de epífitas de la filosfera establecido32 para minimizar el posible sesgo introducido durante la alteración de la biopelícula o la lisis de células microbianas, así como para minimizar la contaminación del ARN del huésped o del ADN genómico al dejar el tejido vegetal intacto. Los kits comerciales de extracción de ARN se basan principalmente en muestras de tejido completo trituradas o batidas con perlas, lo que daría como resultado una mayor sobrerrepresentación de ácidos nucleicos derivados del huésped y potencialmente introduciría un sesgo en la eficiencia de la lisis de las células microbianas.

El Joint Genome Institute (JGI) realizó la preparación de la biblioteca y la secuenciación de las muestras de ARN y ADN enviadas. La preparación de la biblioteca de ADN basada en placas para la secuenciación de Illumina se realizó en el sistema robótico de manipulación de líquidos PerkinElmer Sciclone NGS utilizando el kit de preparación de bibliotecas de Kapa Biosystems. Se cortaron 1,82 ng de muestra de ADN a 436 pb utilizando un ultrasonido enfocado Covaris LE220. Los fragmentos de ADN cortados se seleccionaron por tamaño mediante SPRI doble y luego los fragmentos seleccionados se repararon en los extremos, se les colocó una cola en A y se ligaron con adaptadores de secuenciación compatibles con Illumina de IDT que contienen un código de barras de índice molecular único para cada biblioteca de muestras. Las bibliotecas preparadas se cuantificaron utilizando el kit qPCR de biblioteca de secuenciación de próxima generación de KAPA Biosystems y se ejecutaron en un instrumento de PCR en tiempo real Roche LightCycler 480. La secuenciación de la celda de flujo se realizó en el secuenciador Illumina HiSeq 2500 siguiendo una receta de ejecución indexada de 2 × 151.

En JGI, la preparación de muestras de ARN en placas se realizó en el sistema robótico de manipulación de líquidos PerkinElmer Sciclone NGS utilizando el kit de eliminación de ARNr Ribo-Zero de Illumina (bacterias) y el kit de preparación de muestras TruSeq Stranded Total RNA HT siguiendo el protocolo descrito por Illumina en su documento de usuario. guía: https://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseqstranded-total-rna.html, y con las siguientes condiciones: material de partida de ARN total de 100 ng por muestra y diez ciclos de PCR para amplificación de la biblioteca. Las bibliotecas preparadas se cuantificaron utilizando el kit qPCR de biblioteca de secuenciación de próxima generación de KAPA Biosystems y se ejecutaron en un instrumento de PCR en tiempo real Roche LightCycler 480. La secuenciación de la celda de flujo se realizó utilizando un protocolo de RNASeq de entrada baja con agotamiento de ARNr en el secuenciador Illumina NovaSeq 6000 con kits de reactivos NovaSeq XP V1, celda de flujo S4, siguiendo una receta de análisis indexada de 2 × 151.

Procedimos con el análisis bioinformático (Fig. 2) de 192 observaciones de metagenomas (Datos suplementarios 1) y 78 metatranscriptomas (Datos suplementarios 2) que cumplían con los estándares JGI para la calidad de los datos sin procesar basados ​​en el software propietario de Illumina. Usamos Trimmomatic (v0.39)88 para eliminar adaptadores y filtrar lecturas de baja calidad de archivos fastq usando los siguientes argumentos: PE -phred33 ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE-2.fa:2:30:10:8:TRUE LEADING: 3 TRASERO:3 VENTANA CORREDERA:4:15 MINLEN:36. Después del ensamblaje, las lecturas de la planta huésped se filtraron (tanto para los metagenomas como para los metatranscriptomas) eliminando todas las lecturas asignadas al genoma del pasto varilla (Panicum virgatum v1.0, DOE-JGI, http://phytozome.jgi.doe.gov/) o genoma de miscanthus (Miscanthus sinensis V7.1 http://phytozome.jgi.doe.gov/) usando bowtie2 (v 2.4.1), samtools (v 1.13) y bedtools (v2.30.0)89,90,91 ( Figura S1). Para eliminar las lecturas de hongos y mejorar la señal procariótica en muestras de metagenomas, también filtramos lecturas contra siete genomas de hongos92,93,94,95 que representan parientes cercanos de las especies de hongos más abundantes en este sistema que evaluamos e informamos en nuestro trabajo anterior96 (Tabla S1). Los genomas de estas especies de hongos se recuperaron del JGI Genome Portal o GenBank.

Se crearon dos ensamblajes de metagenomas, uno para switchgrass y otro para miscanthus, basados ​​en metagenomas recolectados en 2016. Estas lecturas de metagenomas filtradas se combinaron y usaron para el coensamblaje (coensamblado por cultivo en 2016) con MEGAHIT (v 1.2.9). usando--kmin-1pass (profundidad de secuenciación baja) y--presets meta-large (metagenoma complejo)97. Además, recuperamos genomas ensamblados en metagenomas (MAG) de las bibliotecas de metagenomas de pasto varilla y miscanthus de 2016 (n = 136 metagenomas) utilizando Metabat (v2.2.15)98. Los ensamblajes MAG se realizaron utilizando lecturas filtradas de pasto varilla y miscanthus muestreados en 2016 por separado para maximizar la integridad y la confiabilidad, como también se hizo en otros estudios99. Para evaluar la calidad y la integridad de los MAG, utilizamos CheckM (v.1.13 con la opción lineage_wf)100. Entre un total de 238 MAG ensamblados a partir de metagenomas de filosfera de pasto varilla o miscanthus (Datos complementarios 3), seleccionamos un subconjunto de MAG en función de: integridad superior al 50% y contaminación inferior al 10%. Identificamos contenedores replicados asociados con MAG usando dRep (v3.2.0, Olm et al. 2017), lo que resultó en la eliminación de un solo MAG. Se eliminó un MAG adicional debido a un reclutamiento de lectura insuficiente en los metatranscriptomas (descritos a continuación) para un total final de 40 MAG focales, incluidos siete de alta calidad y 33 de calidad media38 (Datos complementarios 3).

El reclutamiento de lectura se realizó en los 40 MAG focales38,101. La abundancia del metagenoma de contigs en MAG en cada muestra se estimó en función de la cobertura media de las lecturas de metagenoma filtradas asociadas con cada contig MAG. Específicamente, se usó Bowtie2 (v2.2.2) para alinear lecturas con todos los contigs MAG focales (usando la configuración predeterminada y permitiendo que una sola lectura se asigne a una sola referencia). Se utilizó Bedtools (v2.28) para estimar la cobertura de cada par de bases dentro del contig. La abundancia estimada de un contig se basó en la cobertura mediana del par de bases de todas las lecturas asignadas al contig, y la abundancia estimada de un MAG se basó en la cobertura mediana promedio de todos los contig dentro de sus contenedores (Datos complementarios 4). La abundancia del metatranscriptoma se estimó en función de los genes codificadores de proteínas identificados en los MAG. Para cada contig MAG, se identificaron marcos de lectura abiertos (ORF) y genes funcionales utilizando Prodigal (v2.6.3, parámetros predeterminados). Las transcripciones se asignaron a los ORF asociados con cada MAG para estimar la cobertura de base mediana de cada ORF (Bowtie2, parámetros predeterminados, no se permiten asignaciones múltiples). Para normalizar las diferentes profundidades de secuenciación, estimamos las abundancias normalizándolas por la suma de la cobertura de pares de bases mediana de los genes de mantenimiento en los MAG focales identificados en cada muestra (Datos complementarios 5). Los genes constitutivos se identificaron basándose en el alineamiento completo de la secuencia con los modelos ocultos de Markov (HMM) de 71 genes constitutivos de copia única con un valor E inferior a 1e-5 como estándar102,103. Si no se identificaron genes constitutivos en un metagenoma o metatranscriptoma, las muestras se eliminaron de análisis posteriores. También estimamos las lecturas totales asociadas con cada MAG para metagenomas y metatranscriptomas (Datos complementarios 6) (Un MAG que originalmente había cumplido con los criterios de integridad y contaminación, M22, tuvo un promedio de 48 lecturas en el mapa del metatranscriptoma y luego se eliminó de análisis adicionales. ) Para los análisis de metatranscriptomas, solo se consideraron los ORF con el 75 % superior de las abundancias observadas y detectados en al menos el 10 % de las muestras.

La anotación funcional de ORF en MAG focales se realizó con la herramienta DRAM (v1.1.1104, utilizando las bases de datos UniRef90, MEROPS, PFAM, dbCAN-HMMdb (v8) (todas compiladas con DRAM el 12 de febrero de 2021) y la base de datos KEGG que agregado manualmente a la tubería DRAM (lanzamiento del 1 de enero de 2018). Para obtener funciones relacionadas con el metabolismo de los terpenos, se seleccionaron ORF que estaban asociados con cualquier anotación KEGG que contuviera la frase "terpeno".

A los MAG se les asignó una taxonomía utilizando GTDB-tk (v1.4.0,105). Los MAG focales ensamblados se alinearon contra el genoma del cloroplasto de Panicum virgatum (NC015990) (BLAST, 2.10.1). Detectamos coincidencias parciales con ocho contenedores y no alineamientos completos, lo que confirma que esos contenedores no eran genomas de cloroplasto. Además, comparamos la taxonomía de MAG focales con nuestra cohorte central del gen 16S rRNA detectada previamente32. Esta cohorte consta de 61 OTU bacterianas filogenéticamente diversas (97% de agrupación). La taxonomía de estas 61 OTU se comparó con las 40 MAG a nivel de género. Debido a diferencias en la nomenclatura entre las bases de datos GTDB y SILVA, eliminamos las extensiones para MAG clasificadas como Pseudomonas_E o Aeromonas_A.

El análisis estadístico se realizó en el entorno R para computación estadística (incluidas las versiones entre 2021 y 2023). Las tendencias estacionales crecientes y decrecientes en los roles funcionales se evaluaron mediante regresión lineal. Se realizaron comparaciones por pares de roles funcionales (la suma acumulativa de todos los ORF asociados) entre las temporadas temprana (mayo – junio) y tardía (julio – septiembre) con la prueba bilateral de Kruskal-Wallis basada en la distribución de chi-cuadrado por rangos. , con estaciones tempranas y tardías fueron delineadas por la fenología de la planta (floración/senescencia al final de la estación). La distribución y la dinámica de las transcripciones de MAG se compararon con el método de Ward para la agrupación jerárquica utilizando distancias euclidianas de las abundancias estimadas de metatranscriptomas utilizando pvclust (versión 2.20)106.

Los grupos de genes biosintéticos (BGC) fueron predichos por antiSMASH (v6.0)107 y anotados por Big-SCAPE (v1.1.0)108. Si bien solo se utilizan 8 clases de BGC en Big-SCAPE (es decir, PKS I, otras PKS, NRPS, RiPP, sacáridos, terpenos, híbridos PKS/NRPS y otros), antiSMASH proporciona una clasificación más detallada. Aprovechamos ambos resultados para investigar la diversidad y expresión de BGC predichos en MAG focales. De cada grupo de genes predicho, extrajimos la ubicación del gen biosintético (es decir, gene_kind = "biosintético" y core_position). Para evaluar la transcripción de supuestos BGC dentro de un MAG, buscamos cualquier transcripción que esté asignada a la misma región genómica de genes biosintéticos predichos.

Utilizamos gapseq109 para predecir rutas metabólicas completadas en nuestros MAG focales. Utilizamos la opción 'find -p all –b 200' para buscar rutas en la base de datos MetaCyc. Filtramos las vías incompletas y las vías restantes se agruparon en categorías más amplias utilizando la clasificación MetaCyc y las seleccionamos manualmente para centrarnos en la comprensión de las vías relevantes para el entorno vegetal o para las interacciones microbianas con las plantas. Estas categorías se definieron como posible participación en: i) planta (utilizando metabolitos/componentes celulares de la planta), ii) fitohormona (participación conocida/potencial en la homeostasis de las fitohormonas), iii) estrés (p. ej., sequía, especies reactivas de oxígeno), y iv) general (vías que utilizan posibles productos derivados de plantas). Además, también buscamos manualmente genes/vías que gapseq omitió pero que se sabe que están relacionados con la adaptación al estilo de vida asociado a las plantas, incluidos los sistemas de secreción110,111, la oxidación de gases traza (H2 y CO)112,113, la degradación de oxalato y producción/degradación de fitohormonas. De manera similar a nuestro análisis de genes biosintéticos, la actividad de las vías predichas se estimó en función de las transcripciones asignadas a genes identificados. Se alinearon contigs de MAGS focales (BLAST v2.7.1 +) contra nueve genes de biosíntesis de precursores de isoprenoides informados previamente40. El resultado principal de cada consulta se consideró y aceptó como alineado si el valor E era inferior a 1e-5.

Para evaluar la presencia de MAG en otros metagenomas asociados a pasto varilla y miscanthus recolectados en el campo, utilizamos 55 metagenomas públicos de suelo de pasto varilla, miscanthus y maíz (Datos complementarios 7). Las lecturas de metagenomas se asignaron a MAG focales utilizando los mismos métodos de mapeo y estimación de abundancia descritos anteriormente para los metagenomas generados en este estudio.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de metagenoma y metatranscriptoma sin procesar y procesados ​​generados en este estudio se han depositado en la base de datos del Portal del Genoma del Joint Genome Institute bajo la propuesta ID 503249 [https://genome.jgi.doe.gov/portal/Seadynanfunction/Seadynanfunction.info.html] . Los datos MAG generados en este estudio se han depositado en NCBI bajo el bioproyecto PRJNA800073. Los metadatos, incluidos los estándares de metadatos para metagenomas, metatranscriptomas y genomas ensamblados en metagenomas, para este estudio se proporcionan en los Datos complementarios 1 a 7. Los datos originales se proporcionan con este documento.

El código anotado y los enlaces a datos y metadatos están disponibles en GitHub (https://github.com/ShadeLab/PAPER_Howe_2021_switchgrass_MetaT) y Zenodo (https://zenodo.org/record/10040).

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El apoyo a esta investigación fue brindado por el Centro de Investigación de Bioenergía de los Grandes Lagos, Departamento de Energía de EE. UU., Oficina de Ciencias, Oficina de Investigación Biológica y Ambiental (Premios DE-SC0018409 y DE-FC02-07ER64494), por la Fundación Nacional de Ciencias a largo plazo. Programa de Investigación Ecológica (DEB 1637653 y 1832042) en la Estación Biológica Kellogg, AgBioResearch de la Universidad Estatal de Michigan y por el Centro DOE para la Innovación Avanzada en Bioenergía y Bioproductos (Departamento de Energía de EE. UU., Oficina de Ciencias, Oficina de Investigación Biológica y Ambiental con el número de premio DE-SC0018420). Este trabajo también fue apoyado en parte por la Universidad Estatal de Michigan a través de recursos computacionales proporcionados por el Instituto de Investigación Cibernética y en parte por el Instituto de Energía de la Universidad de Wisconsin-Madison Wisconsin con el apoyo de los Servicios de Información GLBRC. El trabajo [propuesta:10.46936/10.25585/60000818] realizado por el Instituto Conjunto del Genoma del Departamento de Energía de EE. UU. [https://ror.org/04xm1d337], una instalación para usuarios de la Oficina de Ciencias del DOE, cuenta con el apoyo de la Oficina de Ciencias de la El Departamento de Energía de EE. UU. operó bajo el contrato No. DE-AC02-05CH11231. AS agradece el apoyo del Instituto Nacional de Alimentación y Agricultura del USDA y AgBioResearch de la Universidad Estatal de Michigan. NS agradece el apoyo del Instituto de Resiliencia Vegetal de la Universidad Estatal de Michigan.

ashley sombra

Dirección actual: Univ Lyon, CNRS, INSA Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, Ecole Centrale de Lyon, Ampère, UMR5005, 69134, Ecully cedex, Francia

Departamento de Ingeniería Agrícola y de Biosistemas, Universidad Estatal de Iowa, Ames, IA, 50011, EE. UU.

Adina Howe, Shane K. Dooley y Fan Yang

Departamento de Bioinformática y Biología Computacional, Universidad Estatal de Iowa, Ames, IA, 50011, EE. UU.

Adina Howe y Shane K. Dooley

Centro de Innovación Avanzada en Bioenergía y Bioproductos, Ames, IA, 50011, EE. UU.

Adina Howe

Centro de Investigación de Bioenergía de los Grandes Lagos, Universidad Estatal de Michigan, East Lansing, MI, 48824, EE. UU.

Nejc Stopnisek, Keara L. Grady y Ashley Shade

Departamento de Microbiología y Genética Molecular, Universidad Estatal de Michigan, East Lansing, MI, 48824, EE. UU.

Nejc Stopnisek, Keara L. Grady y Ashley Shade

Instituto de Resiliencia Vegetal, Universidad Estatal de Michigan, East Lansing, MI, 48824, EE. UU.

Nejc Stopnisek y Ashley Shade

Departamento de Ciencias Vegetales, del Suelo y Microbianas, Universidad Estatal de Michigan, East Lansing, MI, 48824, EE. UU.

ashley sombra

Programa en Ecología, Evolución y Comportamiento, Michigan State University, East Lansing, MI, 48824, EE. UU.

ashley sombra

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KLG y AS idearon y diseñaron experimentos; NS, KLG y AS realizaron los experimentos; AH, NS, SKD, FY y AS analizaron los datos; AH, NS, SKD, FY, KLG y AS contribuyeron con materiales y herramientas de análisis; y AH, NS, SKD, FY, KLG y AS escribieron el artículo.

Correspondencia a Ashley Shade.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

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Reimpresiones y permisos

Howe, A., Stopnisek, N., Dooley, SK et al. Actividades estacionales del microbioma de la filosfera de cultivos perennes. Nat Comuna 14, 1039 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36515-y

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Recibido: 08 de noviembre de 2022

Aceptado: 03 de febrero de 2023

Publicado: 23 de febrero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36515-y

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