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Jun 04, 2023

Una mutación puntual en recC asociada con el reemplazo subclonal de carbapenem

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 2464 (2023) Cite este artículo 2206 Accesos 2 Detalles de Altmetric Metrics La adaptación a presiones selectivas es crucial para patógenos clínicamente importantes

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 2464 (2023) Citar este artículo

2206 Accesos

2 altmétrico

Detalles de métricas

La adaptación a presiones selectivas es crucial para que patógenos clínicamente importantes establezcan epidemias, pero los impulsores evolutivos subyacentes siguen sin comprenderse bien. La actual epidemia de Klebsiella pneumoniae resistente a carbapenems (CRKP) plantea una amenaza importante para la salud pública. En este estudio analizamos las secuencias del genoma de 794 aislados del torrente sanguíneo de CRKP recolectados en 40 hospitales de China entre 2014 y 2019. Descubrimos un reemplazo subclonal en el clon predominante ST11, donde el subclon previamente prevalente OL101:KL47 fue reemplazado por O2v1:KL64 durante tiempo de forma escalonada. O2v1:KL64 portaba una mayor carga de elementos genéticos móviles, y una mutación puntual detectada exclusivamente en el recC de O2v1:KL64 promueve significativamente la capacidad de recombinación. El éxito epidémico de O2v1:KL64 se asoció además con un sublinaje hipervirulento con mayor resistencia a la fagocitosis, sulfametoxazol-trimetoprima y tetraciclina. Las alteraciones fenotípicas se relacionaron con la sobrerrepresentación de determinantes de hipervirulencia y genes de antibióticos conferidos por la adquisición de un plásmido de virulencia similar a pLVPK positivo para rmpA y un plásmido multirresistente de tipo IncFII, respectivamente. La difusión del sublinaje se vio favorecida aún más por una transmisión interhospitalaria más frecuente. Los resultados demuestran colectivamente que la expansión de O2v1:KL64 se correlaciona con un repertorio de alteraciones genómicas convergentes en una subpoblación con ventajas evolutivas.

Klebsiella pneumoniae es un patógeno nosocomial importante en todo el mundo y su notable capacidad para adquirir resistencia a los antibióticos facilita en gran medida su diseminación generalizada. En la última década, la tasa de K. pneumoniae multirresistente (MDR), particularmente K. pneumoniae resistente a carbapenémicos (CRKP), tiene una tendencia ascendente a nivel mundial y está asociada con una enorme carga de salud pública global1,2,3. En particular, las infecciones del torrente sanguíneo (BSI) causadas por CRKP desafían en gran medida los tratamientos clínicos, lo que resulta en una alta tasa de mortalidad de hasta más del 50% en entornos nosocomiales4,5. La Organización Mundial de la Salud ha incluido CRKP en una lista de patógenos prioritarios resistentes a los antimicrobianos para los que se necesitan con urgencia nuevos antibióticos.

La rápida expansión de CRKP se ha atribuido a la adquisición de carbapenemasas así como al establecimiento de clones exitosos (es decir, clones de alto riesgo). La estructura poblacional de CRKP varía geográficamente6. En Asia, especialmente China, la secuencia tipo (ST) 11 productora de KPC-2 es predominante y representa hasta el 60-70% de CRKP3. ST258, un supuesto descendiente de ST11, se ha convertido en el clon productor de KPC-2/KPC-3 más prevalente en América del Norte, América Latina y Europa2,6,7. Aunque estos clones han mantenido una alta prevalencia en determinadas regiones durante décadas, se han observado segregaciones intraclonales. Se han identificado más de dos subclones en la población ST11 y ST258, y se supone que las recombinaciones que involucran el locus de síntesis de polisacáridos de la cápsula (CPS) son las principales responsables de la diversificación genética4,8,9. Recientemente revelamos un cambio subclonal entre los aislados del torrente sanguíneo CRKP-ST11 recolectados en un solo centro en China entre 2013 y 2017, donde ST11-KL47 había sido desplazado por ST11-KL64 como el subclon predominante4. Lo que es más preocupante es que ST11-KL64 ha desarrollado una patogenicidad mejorada, lo que resulta en una mortalidad a 30 días significativamente mayor en comparación con ST11-KL47. Sin embargo, la dinámica espaciotemporal y las fuerzas impulsoras subyacentes de la estructura poblacional siguen siendo poco comprendidas.

En este trabajo, investigamos la evolución genómica de 794 aislados de CRKP recopilados en el marco de la vigilancia nacional de aislados del torrente sanguíneo entre 2014 y 2019 en China para dilucidar la estructura poblacional dinámica espacial y temporal de CRKP-ST11 y analizar los impulsores genéticos y fenotípicos. de la diversificación intraclonal. Las alteraciones genómicas que se correlacionan con el cambio subclonal y las variaciones fenotípicas en la población ST11 dominante se caracterizan y vinculan con impulsores evolutivos.

Entre 2014 y 2019, se recolectaron 4635 aislamientos del torrente sanguíneo del complejo de especies de K. pneumoniae en 45 hospitales centinela distribuidos en 19 provincias que cubren el 75,7% de la población de China (aproximadamente 1,06 mil millones) (Fig. 1a). Se identificaron un total de 794 aislamientos de CRKP no repetitivos en 40 hospitales de 16 provincias, incluidos 772 K. pneumoniae sensu estricto, 10 K. variicola, 11 K. quasipneumoniae y 1 K. michiganensis (que no pertenece al complejo de especies de K. pneumoniae). pero se incluyó en el análisis) (Figura 1 complementaria y Conjunto de datos complementario 1). La proporción de CRKP aumentó del 11,2% al 17,7% durante el período de estudio (Fig. 1b). La estructura de la población de CRKP-BS era muy compleja y se detectaron 72 ST (conjunto de datos complementario 1). ST11 fue el clon predominante (81,4%; 646/794), seguido de ST15 (55/794; 6,93%).

a Distribución geográfica de los 45 hospitales centinela que participan en este estudio. El número de aislamientos recolectados en cada provincia se muestra mediante degradados de color a la derecha. b El gráfico muestra el número (barras de color rojo oscuro) y la proporción de CRKP (línea roja) detectados cada año durante la vigilancia. c El gráfico muestra el número de O2v1:KL64 y OL101:KL47 detectados en CRKP (barras azules) cada año, y la proporción de O2v1:KL64 a CRKP-ST11 (línea morada) y OL101:KL47 a CRKP-ST11 (línea azul). ). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Se detectaron uno o más genes de carbapenemasa en 771 de 794 aislados (97,1%), y 753 pertenecían a K. pneumoniae sensu estricto, que codificaba blaKPC-like (n = 712; incluidos 709 blaKPC-2 y 3 blaKPC-3), blaNDM. -genes similares (n = 36), similares a blaIMP (n = 4) y similares a blaOXA-48 (n = 5) (Conjunto de datos complementario 1). La mayoría de los aislamientos sensu estrictos de K. pneumoniae positivos similares a blaKPC (686/712; 96,3%) pertenecen a ST11 y ST15, lo que sugiere una diseminación clonal de genes similares a blaKPC en China.

Identificamos 55 loci K (KL, loci de síntesis de cápsulas) y diez loci O (OL, loci de síntesis de lipopolisacáridos externos) en la población CRKP-BS (Conjunto de datos complementario 1). ST11 comprendía 13 KL y 8 OL, de los cuales KL64 (422/646; 65,3%) y O2v1 (418/646; 64,8%) fueron los más prevalentes, seguidos por KL47 (192/646; 29,7%) y OL101 (un O12). derivado) (193/646; 29,9%). ST15 incluyó 5 KL y 5 OL, y predominaron KL19 (43/56; 76,8%) y O2v1 (42/56; 75%). La proporción de OL101:KL47 entre CRKP-ST11 cayó del 78,1% (25/32) en 2014 al 9,7% (22/226) en 2019, mientras que la de O2v1:KL64 (se incluyeron 4 aislados OL102:KL64 para simplificar el análisis). a través del estudio) aumentó del 15,6% (5/32) en 2014 al 81,4% (184/226) en 2019 (Fig. 1c). Los hallazgos demuestran que se ha producido reemplazo subclonal de OL101:KL47 a O2v1:KL64 dentro de la población ST11 en China. El subclon O2v1:KL19 prevaleció constantemente en ST15 durante el período de estudio (66,7%-87%).

Para determinar la relación filogenética de estos subclones ST11, se derivó un árbol de máxima probabilidad a partir de 4460 SNP libres de recombinación. Un clado que comprende aislados de O2v1:KL103, O2v2:KL105, O3b:KL111 y O4:KL15 fue basal en el árbol (Fig. 2), presentando el clado ancestral de los aislados ST11. Todos los aislados de O2v1:KL64 se agruparon para formar el clado de ramificación más profunda y también se agruparon con un sublinaje de OL101:KL47, lo que indica que O2v1:KL64 se derivó de OL101:KL47. Esto es consistente con nuestra conclusión anterior a partir de datos de un solo centro4. Los otros serotipos se agruparon con OL101:KL47 (O3/O3a:KL10 y O5:KL25) o con O2v1:KL64 (O2v1:KL21, O2v1:KL28, O2v1:KL31, O2v1:KL103, O2v1:KL107 y O3/O3a. :KL58), apoyando la idea de que evolucionaron a partir de los dos subclones principales.

El árbol filogenético se obtuvo mapeando todas las lecturas de secuencia en el ensamblaje híbrido de un aislado ST11-OL101:KL47 (KP16932) y eliminando las regiones recombinadas del alineamiento. El árbol se enraizó utilizando los aislados del grupo externo ST258 (triángulo gris). En nuestra colección ST11 se detectaron trece combinaciones O/K, las cuales están indicadas en diferentes colores, como muestra la leyenda. A continuación se muestran los biomarcadores de hipervirulencia detectados (a excepción de iro por su rareza en nuestra colección). Se muestran los ARG [blaLAP-2, tipo dfrA, tipo qnr, tipo sul, tet(A) y oqxAB] detectados con abundancia significativamente diferente entre OL101:K47 y O2v1:KL64. Aquí se muestran los tipos de replicón correspondientes a la virulencia predominante [IncHI1B(pNDM-MAR) e IncFIB(Kpn3)] y el plásmido MDR [IncFII(pCRY)] que porta estos ARG (excepto oqxAB). El alelo RecC (RecCHis935Arg) se detectó exclusivamente en O2v1:KL64, como se muestra en la rama, y ​​la referencia (KP37485) utilizada en el ensayo de recombinación se indica en el árbol. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Identificamos 42.824 SNP del genoma central antes y 4460 SNP después de la eliminación de las regiones de recombinación, lo que sugiere que la recombinación ha contribuido en gran medida a la diversidad de la población. Estos incluyen una región de 96,1 kb y 12,1 kb que abarca el locus CPS y lipopolisacárido (LPS) que introdujeron 1182 y 261 SNP, respectivamente, lo que explica el cambio de OL101:KL47 a O2v1:KL64 (Figura complementaria 2). Hubo eventos de recombinación adicionales que abarcaron la región CPS y/o LPS que se detectaron en los subclones derivados de OL101:KL47/O2v1:KL64 y estos también confirieron cambios en los tipos O/K.

Para estimar aún más el papel de la recombinación en las variaciones genéticas de O2v1:KL64 y OL101:KL47, calculamos la divergencia de nucleótidos para todos los pares de genomas dentro de los dos subclones antes y después de la eliminación de las regiones de secuencia recombinante. Se detectó menos divergencia de nucleótidos en O2v1:KL64 que en OL101:KL47 antes (mediana de divergencia por pares: 4,2 × 10−5 frente a 1,5 × 10−4; p < 2,2 × 10−16 según la prueba de suma de rangos de Wilcoxon) y después de la eliminación. de regiones de recombinación (1,3 × 10−5 frente a 2,1 × 10−5; p <2,2 × 10−16) (Figura complementaria 3). Probablemente esto se deba al hecho de que O2v1:KL64 surgió más tarde que OL101:KL47 y ha tenido menos tiempo para acumular diversidad genética. El valor r/m de O2v1:KL64 fue aproximadamente 2,5 veces mayor que el de OL101:KL47 (17,68 frente a 7,28), lo que sugiere que la contribución de la recombinación a las variaciones genéticas fue mayor en O2v1:KL64 que en OL101:KL47.

Dado el mayor valor r/m detectado en O2v1:KL64 en comparación con OL101:KL47, y más serotipos derivados de O2v1:KL64 (n = 7) que de OL101:KL47 (n = 2), supusimos que O2v1:KL64 podría tener evolucionó con mayor capacidad de recombinación. Para probar la hipótesis, examinamos los SNP específicos de subclones asociados con la recombinación, y se encontró una única mutación sin sentido en el gen recC (2804 A > G; His935Arg) exclusivamente en O2v1:KL64 en comparación con la secuencia de OL101:KL47. Se sabe que se requiere recC funcional para la recombinación genética en Escherichia coli, y las mutaciones en recC pueden afectar la capacidad de recombinación10. Diseñamos un mutante O2v1:KL64 (KP37485ΔrecC) y confirmamos que la eliminación de recC de hecho abolió la capacidad de recombinación reflejada por la resistencia al agente dañino del ADN mitomicina C11, que podría restaurarse mediante la complementación con recCO2v1:KL64 o recCOL101:KL47 (Fig. .3), lo que demuestra que recC participa en la recombinación en K. pneumoniae al igual que en E. coli.

Se recogieron células de fase logarítmica tardía cultivadas en caldo LB con 0,2% (p/v) de l-arabinosa y 25 mg/l de cloranfenicol y se resuspendieron en PBS para obtener 5 x 108 ufc/ml, seguido de tratamiento con PBS (a) o mitomicina C a 8 mg/L (b) durante 1 h. Los cultivos se diluyeron en serie diez veces, se mancharon con 10 ul en filas en placas LB y se incubaron durante la noche a 37 °C. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para validar si la mutación única sin sentido de recC podría afectar la capacidad de recombinación, diseñamos un mutante isogénico KP37485-recCOL101:KL47 reemplazando recCO2v1:KL64 con recCOL101:KL47. Aparte de 2804 A > G, no se encontraron otros SNP en el genoma de KP37485-recCOL101:KL47 confirmado mediante secuenciación. En comparación con KP37485, se observó una reducción triple de la resistencia a la mitomicina C para KP37485-recCOL101:KL47 [índice de supervivencia: (1,85 ± 0,38) × 10−6 frente a (0,62 ± 0,05) × 10−6); p = 0,0295 mediante prueba t], lo que indica que la mutación única en el gen recC tiene un efecto sobre la capacidad de recombinación. Además, diseñamos un experimento de transducción para validar el impacto de los dos alelos recC en la frecuencia de recombinación (Figura complementaria 4). KP37485 mostró una frecuencia de recombinación 245 veces mayor que KP37485-recCOL101:KL47 [media (1,38 ± 0,48) × 10−8 frente a (5,62 ± 0,44) × 10−11; p = 0,0388 mediante prueba t], mientras que la recombinación homóloga fue indetectable en KP37485ΔrecC. Los resultados demuestran que la única mutación sin sentido en el gen recC puede mejorar significativamente la capacidad de recombinación.

Analizamos además 14,407 genomas de K. pneumoniae recuperados de la base de datos NCBI RefSeq en noviembre de 2022 para determinar la distribución de recCHis935Arg, y el alelo se encontró exclusivamente en 763 de 823 aislados ST11 O2v1:KL64 (conjunto de datos complementarios 2). Todos menos uno de los aislados positivos para recCHis935Arg se recolectaron en China, lo que indica que recCHis935Arg era específico de los aislados ST11 O2v1:KL64 chinos.

Se sabe que la recombinación y la transferencia horizontal de genes son vitales para dar forma a las estructuras del genoma de las bacterias al afectar el intercambio de materiales genéticos, por ejemplo, MGE12. Aquí analizamos MGE en los 646 genomas ST11, incluidos integrones, secuencias de inserción (IS), profagos y plásmidos (aproximados por replicones), para identificar mecanismos adicionales involucrados en la diversificación de CRKP-ST11. Se encontró una carga significativamente mayor de profagos, replicones e IS en O2v1:KL64 en comparación con OL101:KL47 (mediana 9 frente a 8; 6 frente a 4; y 22 frente a 18, respectivamente) (prueba de suma de rangos de Wilcoxon: p = 2,2 × 10-16; 2,2 × 10-16; 1,87 × 10-8) (Figuras complementarias 5a-d), mientras que el número de integrones fue comparable en los dos subclones con una distribución significativamente diferente (mediana 2 frente a 2; p = 6,88 × 10−9) (Figura complementaria 5e). Se encontró una tendencia similar entre ST11 y no-ST11 (Figura complementaria 6). Para comprender mejor si las diferencias en profagos, plásmidos e IS entre los dos subclones se debieron a una transferencia vertical u horizontal, reconstruimos los estados ancestrales de estos MGE. Nuestros resultados indican que la expansión a gran escala de plásmidos e IS dentro de O2v1: KL64 probablemente fue causada por un único evento de adquisición (Fig. 4a, b), que respalda el modelo vertical. Por el contrario, encontramos que las diferencias en los profagos probablemente se debieron a múltiples eventos de adquisición y pérdida dentro de O2v1: KL64 (Fig. 4c), lo que sugiere un patrón más complejo de transferencia horizontal. Estos hallazgos respaldan el papel fundamental de los MGE, especialmente de los profagos y plásmidos, en la configuración de la estructura poblacional de CRKP-ST11.

MGE se mapeó como un carácter continuo en el árbol filogenético calculado por los 646 genomas ST11. Evolución reconstruida con el paquete R phytools en el conjunto de datos, incluido el número de replicones de plásmidos (a), copias IS (b), profagos (c) y profagos de Siphoviridae (d) identificados por genoma. Los colores se asignan en función del número de MGE detectados por genoma, como lo indican las barras. El subclon O2v1:KL64 está resaltado con un cuadro gris. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Se sabe que las presiones selectivas inducidas por fagos desempeñan un papel fundamental en el cambio de serotipo de K. pneomoniae13. Por lo tanto, examinamos si la presencia y el tipo de fagos posiblemente estuvieran involucrados en la diversificación intraclonal de CRKP-ST11. La mayoría de los profagos detectados (95,03%) se clasificaron en tres familias: Myoviridae, Podoviridae y Siphoviridae. La carga de profagos Myoviridae y Podoviridae fue comparable entre los dos subclones (mediana 92 ​​kb; 19,8 kb), mientras que la de profagos Siphoviridae fue significativamente mayor en O2v1:KL64 que en OL101:KL47 (mediana 95 kb vs 60,3 kb) (p = 2,2 × 10 −16 según la prueba de suma de rangos de Wilcoxon) (Figura complementaria 5f – h). Al igual que con los plásmidos y los IS, la expansión generalizada de los profagos de Siphoviridae probablemente fue el resultado de un único evento de adquisición dentro de O2v1: KL64 (Fig. 4d).

Para evaluar la patogénesis potencial de O2v1:KL64 y OL101:KL47, se analizaron 154 factores de virulencia (VF) validados experimentalmente de K. pneumoniae (ver métodos). O2v1:KL64 tenía significativamente más determinantes de virulencia que OL101:KL47 (mediana 97 frente a 85) (p = 2,2 × 10-16 según la prueba de suma de rangos de Wilcoxon) (Figura complementaria 7). Un conjunto de VF clave (es decir, iucABCD, terABCDEZ, peg-344, rmpADC y rmpA2) asociados con hipervirulencia y típicamente movilizados por plásmidos de virulencia8,14 contribuyeron principalmente a las diferencias intersubclonales (Conjunto de datos complementario 3), y sus proporciones fueron significativamente mayor en O2v1:KL64 (56,9–71,1%) que en OL101:KL47 (0–41,1%) (p ≤ 2,82 × 10−9 mediante la prueba de Chi-cuadrado para cada comparación por pares). En particular, rmpADC fue transportado exclusivamente por O2v1:KL64 con una tasa del 56,9 % (240/422). Se detectaron rmpA con marco desplazado y rmpADC incompleto en el 21,3% (51/240) y el 9,2% (22/240) de los aislados O2v1:KL64 positivos para rmpADC, respectivamente. Mientras que rmpA2 se encontró en OL101:KL47 (74/192) y O2v1:KL64 (290/422), se detectó rmpA2 con desplazamiento de marco en el 67,6 y el 98,6 % de OL101:KL47 (50/74) y O2v1:KL64 positivos para rmpA2. (286/290) aislados, respectivamente. Esto es similar a nuestra observación anterior a partir de datos de un solo centro4. Dado que rmpA/A2 se utiliza con frecuencia como indicador de plásmidos de virulencia, aquí simplemente definimos los aislados positivos para rmpA/A2 como hvKP. Los aislados O2v1:KL64-hvKP surgieron en 2015 y se detectaron en nueve provincias. La proporción de O2v1:KL64-hvKP entre O2v1:KL64 y CRKP-ST11 aumentó drásticamente del 0% en 2014 al 85,9% (158/184) y al 69,9% (158/226) en 2019 (Figura complementaria 8), respectivamente. lo que sugiere que la expansión de O2v1:KL64 se asoció con un aumento en el tamaño de la población de hvKP.

Para confirmar la existencia de plásmidos de virulencia en ST11, las lecturas de los 646 genomas ST11 se asignaron a dos plásmidos de virulencia representativos pVir-KP16932 (portado por un aislado ST11-OL101:KL47) y pVir-KP47434 (portado por un aislado ST11 O2v1:KL64). ) informado en nuestro estudio anterior4, y se infirió la presencia de un plásmido de virulencia si la cobertura era ≥40% de la referencia. Identificamos 400 aislados (61,9%) que podrían portar un plásmido de virulencia (Conjunto de datos complementario 4). De estos, 33 aislados (13 OL101:KL47 y 20 O2v1:KL64) con una cobertura de mapeo que oscilaba entre 40% y 100% se seleccionaron al azar para una secuenciación de lectura larga para examinar la diversidad de plásmidos de virulencia (Conjunto de datos complementario 5). Los genes rmpA/A2 se detectaron en el cromosoma de 3 aislados OL101:KL47 y en un supuesto plásmido de virulencia en cada uno de los 30 aislados, con un tamaño que oscilaba entre 101,5 y 305,5 kb (Conjunto de datos complementario 6). Los 30 plásmidos de virulencia putativa se tipificaron como IncFIB-HIB (n = 25), IncFIB (n = 2), IncFII-FIB-R (n = 2) y no tipificables (n = 1), y se agruparon en cuatro grupos por MOB-suite15 con AA406 como grupo predominante (Conjunto de datos complementario 6). De estos, 13 plásmidos compartían una columna vertebral relativamente conservada (cobertura del 75,5 al 100%), otros 10 con un tamaño más pequeño podían derivarse de ellos o viceversa mediante ganancia o pérdida de genes (cobertura del 67,3 al 100%), y los otros siete eran plásmidos de fusión de resistencia-virulencia que portaban de 1 a 10 genes de resistencia a los antimicrobianos (ARG) con una cobertura menor que las referencias de plásmidos de virulencia (≤60%) (Conjunto de datos complementario 6 y Figura complementaria 9). El mapeo de las lecturas de secuencia corta de 389 aislados ST11 positivos para rmpA/A2 con las 30 secuencias de plásmidos de virulencia putativa identificó 347 (89,2%) que muestran una cobertura ≥90% con un plásmido IncFIB circularizado de 107,1 kb pVir-KP115906 que produjo el mayor número de coincidencias. . Estos datos indican que la mayoría de los aislados positivos para rmpA/A2 albergaban plásmidos de virulencia. La comparación de las posiciones filogenéticas del genoma y las similitudes en la secuencia del plásmido indicó modos tanto horizontales como verticales de transmisión de plásmidos de virulencia entre OL101:KL47 y O2v1:KL64 (Figura complementaria 9).

Se sabe que los plásmidos de virulencia pueden promover la patogenicidad de K. pneumoniae; Aquí medimos la fagocitosis para evaluar la patogenicidad de aislados sin plásmidos de virulencia. Los aislados de cada subclon se agruparon según la presencia de rmpA/A2 (el indicador de plásmidos de virulencia) y se seleccionaron aleatoriamente tres aislados para cada grupo en la prueba. De hecho, en comparación con aquellos sin plásmidos de virulencia, los aislados positivos para rmpA/A2 de ambos subclones mostraron una mayor resistencia a la fagocitosis, pero sólo fue significativa para O2v1:KL64 (fagocitosis media 0,017 ± 0,023% frente a 0,2 ± 0,049%; p = 0,0043 por prueba t bilateral) (Fig. 5a).

a Comparación de la resistencia a la fagocitosis para aislados sin plásmidos de virulencia (indicada por la presencia de rmpA/A2). Se seleccionaron aleatoriamente tres aislados para cada grupo en la prueba, es decir, O2v1:KL64-rmpA/A2 + (KP33367, KP47434 y KP66639), O2v1:KL64-rmpA/A2- (KP33316, KP37485 y KP39199), OL101: KL47-rmpA/A2 + (KP16932, KP41051 y 46882) y OL101:KL47-rmpA/A2- (KP30412, KP43350 y KP73269). El ensayo se triplicó y las barras de error representan desviaciones estándar. Se utilizaron pruebas t de Student para comparaciones de grupos por pares, y los aislados O2v1:KL64 positivos para rmpA/A2 mostraron una resistencia significativamente mayor a la fagocitosis que los aislados O2v1:KL64 negativos para rmpA/A2 (p = 0,0043). Los diagramas de caja se muestran utilizando el método de Tukey (línea central, mediana; límites de caja, cuartiles superior e inferior; bigotes, último punto dentro de un rango intercuartil de 1,5x). ns, no significativo; *p < 0,01; b Distribución de ARG con diferencias significativas entre OL101:KL47 y O2v1:KL64 sin plásmidos de virulencia. Se compara el índice de resistencia de los fármacos (ciprofloxacino, tetraciclina y sulfametoxazol-trimetoprima) asociados con estos ARG. Dado que el punto de corte de la tetraciclina no está disponible para K. pneumoniae, aquí utilizamos MIC ≥ 256 mg/L para representar un alto nivel de resistencia. *p < 0,01 (prueba de Chi-cuadrado). c ARG asociados con plásmidos de virulencia (indicados por la presencia de rmpA/A2) en OL101:KL47 (n = 192) y O2v1:KL64 (n = 422). Los círculos indican odds ratios estimados en un único modelo de regresión logística multivariable con todos los genes; Las líneas indican intervalos de confianza del 95% para esos odds ratios. La mediana se utilizó como medida del centro de las barras de error en los paneles a y c. Todas las pruebas estadísticas realizadas fueron bilaterales. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para explorar si los antibióticos estuvieron involucrados en la selección subclonal, analizamos genes adquiridos de resistencia a antibióticos (ARG) para ambos subclones. El número de ARG adquiridos fue comparable entre O2v1:KL64 (mediana 11) y OL101:K47 (mediana 10) (p = 0,96 según la prueba de suma de rangos de Wilcoxon) (Figura complementaria 10). Sin embargo, de estos con una proporción ≥50% en cualquiera de los subclones, la abundancia de oqxAB fue significativamente mayor en OL101:KL47 (p ≤ 5,69 × 10−12 mediante la prueba de Chi-cuadrado), mientras que la de blaLAP-2, similar a dfrA, Los tipos qnr, sul y tet(A) fueron significativamente mayores en O2v1:KL64 (p ≤ 1,23 × 10−3 según la prueba de Chi-cuadrado) (Fig. 5b y conjunto de datos complementarios 7). Se encontró una fuerte correlación entre la presencia de estos ARG y rmpA/A2 en O2v1:KL64 (p <2,2 × 10-16), pero no en OL101:KL47 (p ≥ 0,05) (Fig. 5c). Además, medimos las CIM de ciprofloxacina, tetraciclina y sulfametoxazol-trimetoprima para 368 aislamientos O2v1:KL64 y 140 OL101:K47. No se encontraron diferencias significativas para la resistencia a ciprofloxacina entre O2v1:KL64 y OL101:K47 (p ≥ 0,95 mediante la prueba de Chi-cuadrado) (Fig. 5b), ya que todos los aislados albergaban un mutante gyrA (Asp87Gly) y un mutante parC (Ser80lle y Asn438Ser). ). Sin embargo, la población O2v1: KL64-hvKP mostró la tasa de resistencia más alta a la tetraciclina y al sulfametoxazol-trimetoprima (Fig. 5b).

Para comprender cómo se capturaron estos ARG, realizamos una secuenciación de lectura larga para 17 aislados (14 O2v1:KL64; 3 OL101:KL47) que portaban al menos dos de blaLAP-2, tipo dfrA, tipo qnr, tipo sul y genes tet(A). Estos ARG se detectaron en los cóntiges que codifican replicones de los 17 genomas, lo que respalda que estaban transmitidos por plásmidos (Conjunto de datos complementario 8). Estos supuestos plásmidos se asignaron a tres tipos Inc (IncFII, IncFII-FIB e IncFII-R) y IncFII fue predominante (13/18). Cada tipo de plásmido compartía una columna vertebral conservada independientemente de los huéspedes, lo que sugiere transferencias horizontales intersubclonales (Figura complementaria 11a). El mapeo de las lecturas de los genomas OL101:KL47 y O2v1:KL64 a estos supuestos plásmidos reveló que el plásmido tipo IncFII prevalecía en O2v1:KL64 (266 genomas mostraron una cobertura >90% respecto a pMDR-KP29007), especialmente en O2v1:KL64-hvKP. (241/266), pero poco común en OL101: KL47 (12 genomas mostraron una cobertura> 90% para pMDR-KP29007) (Figura complementaria 11b).

Dado que los diferentes genotipos fueron conferidos por la diversidad genética de los plásmidos de virulencia de tipo IncFIB y los plásmidos MDR de tipo IncFII en O2v1:KL64 descritos anteriormente, intentamos identificar genotipos exitosos en el contexto de los genes asociados transportados por estos plásmidos (Fig. 6). Se detectó un total de 48 genotipos basados ​​en varias combinaciones de estos genes. Los genotipos más prevalentes (genotipos 1 y 2) codifican todos los genes, excepto los de tipo dfrA y/o oqxAB, que representan el 47,9% (202/422) de O2v1:KL64 (Fig. 6a), y la proporción de los dos genotipos en cada año. aumentó drásticamente del 0% al 64,7% (119/184) entre 2014 y 2019 (Fig. 6b), lo que sugiere que ambos podrían ser genotipos exitosos. Por el contrario, el tercer y cuarto genotipos prevalentes (genotipos 3 y 4) no portan ningún gen diana o simplemente codifican oqxAB (Fig. 6a), y su proporción en la población disminuyó desde el pico (63%; 17/27) en 2015 al 4,9% (9/184) en 2019 (Fig. 6b).

a La matriz de combinación (abajo) muestra los genotipos previstos de O2v1:KL64. Dentro de la matriz de combinación, los círculos negros indican la presencia de genes y la combinación vertical de círculos negros representa el genotipo. El número total de cada genotipo se indica debajo de la matriz. La matriz de combinación se creó utilizando el paquete UpSetR73. El diagrama de burbujas (arriba) representa el número relativo de aislamientos con cada genotipo (matriz de combinación) por año. b El gráfico muestra la abundancia relativa de los genotipos 1 y 2 y de los genotipos 3 y 4 por año. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para comprender si el reemplazo subclonal está asociado con un patrón de transmisión alterado, es decir, transmisión intra e interhospitalaria, intentamos discriminar posibles eventos de transmisión recientes utilizando distancias SNP por pares por año (2014-2019). Probamos una variedad de umbrales de SNP para minimizar el sesgo posiblemente introducido por un único límite. El umbral mínimo de SNP se estableció en 14 SNP según la tasa de mutación de nuestra colección y la longitud del genoma de referencia (ver métodos), y el máximo se definió en 25 SNP según estudios epidemiológicos regionales recientes7,16,17,18.

Se observó un cambio significativo en el patrón de transmisión para O2v1:KL64 de 2015 a 2019 (2014 se excluyó del análisis debido al número limitado de aislamientos obtenidos) utilizando cada umbral de 14 a 25 SNP. La fracción de transmisión reciente dentro de los hospitales disminuyó dramáticamente de (100–89,7%) a (71,5–40,9%) para O2v1:KL64, mientras que entre hospitales aumentó dramáticamente de (0–10,3%) a (28,5–59,1%) (p. < 0,05 según la prueba de Mann-Kendall) (Fig. 7). Se observaron dinámicas de transmisión similares para la población O2v1:KL64-hvKP (z = 2,02; p <0,05 según la prueba de Mann-Kendall), pero no para los aislados negativos para rmpA/A2 (Fig. 7). Esto sugiere que la subpoblación hipervirulenta promovió la diseminación de O2v1:KL64 a través de transmisiones interhospitalarias mejoradas. Se observó una estabilidad relativa en la fracción de transmisión reciente dentro ([100–98,6%]–[100–83,3%]) y entre hospitales ([0–1,4%]–[0–16,7%]) para OL101:K47 de 2014. a 2019 (p > 0,05 según la prueba de Mann-Kendall) (Fig. 7), lo que sugiere que el patrón de transmisión de OL101:K47 no tuvo cambios significativos a lo largo del tiempo.

Se identificaron por año los pares de transmisión recientes dentro e interinstalaciones utilizando distancias de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) por pares. Los círculos indican la proporción de pares (eje y) calculada utilizando varios umbrales de distancia SNP por pares (eje x). En este estudio se utilizó una variedad de umbrales (14 a 25 SNP; un área gris) (ver métodos) para identificar pares de transmisión recientes dentro e entre instalaciones para OL101:KL47 (las dos filas superiores) u O2v1:KL64 (las dos filas superiores). dos filas inferiores). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para analizar la epidemiología geográfica y la relación evolutiva de ST11 a nivel subclonal, se realizó un análisis filogenético utilizando los 646 genomas de ST11 junto con 329 borradores de genomas de ST11 disponibles públicamente aislados en 43 países de cuatro continentes (es decir, América, África, Asia, y Europa) (Conjunto de datos complementario 9). Todos los aislados chinos, excepto dos, pertenecen a un solo clado, con siete aislados obtenidos de Francia (supuestamente importados de China19), Canadá, Estados Unidos y Japón (Figura 12 complementaria), lo que sugiere que el clon ST11 evolucionó de forma independiente y se expandió localmente en Porcelana. Tres aislados O3b:KL13 de los Estados Unidos se agruparon con el clado chino.

La mayoría de los aislamientos ST11 globales (269/329) se asignaron a seis sublinajes principales (Figura 12 complementaria), incluidos O2v1:KL24 (n = 66), O2v1:KL64 (n = 21), O2v2:KL27 (n = 36). ), aislados O2v2:KL105 (n = 73), O3:KL125 (n = 17) y O4:KL15 (n = 56). Estos sublinajes mostraron especificidad geográfica: (i) O4:KL15, O2v1:K24 y O3b:KL125, ya que los sublinajes internacionales se han extendido en múltiples países en ≥3 continentes (n = 18 en cinco continentes; n = 19 en cuatro continentes; n = 4 en tres continentes); (ii) O2v2:KL105 circuló principalmente en Europa, especialmente Europa del Este (59/73), y los aislados de O2v2:KL27 se detectaron principalmente en América del Norte y del Sur, lo que sugiere dos continentales; (iii) O2v1:KL64 se encontró principalmente en Brasil (18/21) como un sublinaje local. Es de destacar que los aislados de Brasil O2v1:KL64 eran filogenéticamente distintos de los de China, lo que indica una evolución independiente para este subclon.

El análisis BEAST se realizó utilizando 147 de los 975 genomas para reducir el tiempo de cálculo (ver Métodos) (Figura complementaria 13). La correlación entre las distancias de raíz a punta y el tiempo de muestreo indicó un patrón de evolución molecular relativamente parecido a un reloj (Figura complementaria 14). O2v1:KL64 se derivó de OL101:KL47 alrededor de 2006 d.C. (95% HPD AD 2004-2009) en China, y OL101:KL47 surgió alrededor de 2005 d.C. (95% HPD AD 2002-2008). El ancestro común más reciente (MRCA) de los aislados globales y chinos data aproximadamente de 1983 d.C. (95% HPD 1977-1989 d.C.).

La rápida expansión de CRKP a nivel mundial está impulsada en gran medida por una serie de clones "altamente exitosos", incluido ST11. Sin embargo, los factores que sustentan la exitosa propagación de la epidemia siguen siendo poco conocidos. Rastrear las variaciones genéticas y fenotípicas de aislados que abarcan un amplio rango de tiempo y geografías nos permite investigar la trayectoria evolutiva y explorar las fuerzas impulsoras subyacentes.

Anteriormente detectamos un cambio subclonal en CRKP-ST11 que causaba infecciones del torrente sanguíneo en un hospital terciario4. En este estudio, demostramos aún más el cambio subclonal durante una encuesta de prevalencia nacional de 6 años. CRKP-ST11 se ha diversificado en dos subclones principales (OL101:KL47 y O2v1:KL64), y OL101:KL47 fue reemplazado gradualmente por O2v1:KL64 con el tiempo. La segregación intraclonal se produciría alrededor del año 2006 d.C. (Figura 13 complementaria), y se debió principalmente a la recombinación de los loci de biosíntesis de cápsulas y LPS, que se han definido como puntos calientes de recombinación sujetos a una fuerte selección diversificadora en K. pneumoniae8. 20. Desde un punto de vista epidemiológico, es muy interesante señalar las presiones selectivas para la prevalencia de O2v1:KL64. De acuerdo con nuestros datos de que el O2 prevalecía en ST11 y ST15, un estudio previo mostró que el serotipo O2 fue dominante en CRKP (50%) en las últimas dos décadas, especialmente en otro clon epidémico ST25821. La prevalencia del antígeno O2 supuestamente se correlaciona con una escasez de anticuerpos anti-O2 en los repertorios de células B humanas21. Estudios adicionales informaron que los pacientes con BSI O2v1:KL64-CRKP tenían una tasa de mortalidad a 30 días significativamente mayor y una tasa de incidencia de sepsis/shock séptico más alta4,22. Estos sugieren que la aparición de O2v1:KL64 está asociada con la susceptibilidad del huésped, lo que resulta en una mayor patogenicidad al evadir la defensa innata del huésped. Por lo tanto, es probable que el cambio subclonal identificado dentro de CRKP-ST11 cause desafíos a las medidas de control de infecciones y estrategias de tratamiento actuales.

Se ha informado sobre reemplazo clonal en múltiples patógenos MDR notorios, y uno de los ejemplos más conocidos es el Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM)23,24. La resistencia y la virulencia evolucionadas asociadas a un conjunto de alteraciones genéticas se han relacionado con la sustitución clonal de MRSA25,26,27. En este estudio, revelamos que el éxito epidémico de O2v1:KL64 está asociado con la expansión de un linaje hipervirulento con la captura de un plásmido de virulencia. Los aislamientos emergentes O2v1:KL64-hvKP se han notificado esporádicamente en varios estudios de vigilancia28,29; sin embargo, ninguno de ellos ha investigado sistemáticamente las caracterizaciones epidemiológicas y evolutivas del linaje. Numerosos estudios han demostrado que los plásmidos de virulencia pueden promover la patogenicidad de K. pneumoniae30,31,32. De hecho, aquí encontramos que O2v1: KL64-hvKP obtuvo una mayor resistencia a la fagocitosis en comparación con aquellos aislados sin plásmidos de virulencia. Nuestro estudio anterior demostró que los plásmidos de virulencia promovieron la invasión de patógenos y la posterior infección clínica, y O2v1:KL64-hvKP mostró una mayor resistencia a la destrucción de neutrófilos4. En conjunto, sus datos confirman que O2v1:KL64-hvKP ha evolucionado para ser más virulento mediante la captura de plásmidos de virulencia. La aparición de O2v1:KL64-hvKP se asocia además con la captura de plásmidos MDR. Se encontró una fuerte correlación entre cinco ARG [es decir, blaLAP-2, tipo dfrA, tipo qnr, tipo sul y tet(A)] y O2v1: KL64-hvKP pero no OL101: KL47 (Fig. 5c). lo cual se debe al enriquecimiento de un plásmido IncFII MDR. En comparación con las otras subpoblaciones, O2v1:KL64-hvKP mostró la mayor resistencia a la tetraciclina y al sulfametoxazol-trimetoprima (Fig. 5b), lo que sugiere que estos dos fármacos podrían haber estado involucrados en la prevalencia de O2v1:KL64-hvKP. O2v1:KL64 y OL101:KL47 mostraron una resistencia comparable a la ciprofloxacina debido a mutaciones en gyrA o parC, mientras que en O2v1:KL64 se encontró pérdida y ganancia adicional de genes oqxAB y qnr, respectivamente. Es de destacar que se ha considerado ampliamente que oqxAB son genes centrales de K. pneumoniae6, pero nuestros resultados mostraron que se perdieron en la mayoría de los aislados O2v1:KL64, posiblemente por mecanismos mediados por IS y/o de recombinación (Figura complementaria 15). . Como bomba de eflujo de múltiples fármacos, OqxAB confiere resistencia baja a intermedia a varios antibióticos (p. ej., quinoxalinas, quinolonas, tigeciclina y nitrofurantoína), detergentes y desinfectantes. La pérdida de OqxAB puede afectar la resistencia al fármaco de O2v1:KL64. Es necesario estudiar más a fondo si tal pérdida podría conferir ventajas evolutivas al éxito de la epidemia.

En las bacterias, la recombinación, la transferencia horizontal de genes y las mutaciones se reconocen como fuentes importantes de variaciones genéticas introducidas en una población. Como se encuentra en otros clones MDR prevalentes (por ejemplo, ST258 y ST15)8, los genomas de ST11 han sido moldeados por frecuentes eventos de recombinación. En particular, nuestro análisis sugirió que la contribución de la recombinación a las variaciones genéticas fue mayor en O2v1:KL64 que en OL101:KL47, y además demostramos que una mutación puntual que se produjo en recC de O2v1:KL64 confirió más capacidad de recombinación, lo cual fue único. a O2v1:KL64 aislado en China. Se sabe que recC, junto con recB y recD, codifica una nucleasa dependiente de ATP, llamada enzima RecBCD, y la vía dependiente de RecBCD es el mecanismo principal de recombinación homóloga y reparación del ADN bicatenario lineal en E. coli. La estructura y función de la enzima RecBCD está regulada por sitios Chi (5′-GCTGGTGG-3′) para estimular la recombinación33. La evidencia actual sugiere que la subunidad RecC reconoce Chi en el túnel 3'34, y se requiere un dominio C-terminal de 35 kDa de RecC para la interacción con la proteína RecD, un requisito previo para la capacidad de respuesta a Chi35. Las mutaciones puntuales en el dominio C-terminal de RecC impiden indirectamente que RecD se asocie con RecBC35, lo que da como resultado el fenotipo de "doble daga": capacidad de recombinación que es independiente de Chi y ausencia de actividades nucleasas36. Es de destacar que la mutación puntual (His935Arg) que ocurre en RecC de O2v1:KL64 se encuentra en el dominio C-terminal; Por lo tanto, inferimos que puede afectar la interacción con RecD y la capacidad de respuesta al Chi para estimular la recombinación. Además, se demostró que las mutaciones que inactivan el gen recB o recC conducen a defectos en múltiples funciones biológicas, incluida la conjugacional, transduccional y la recombinación de fagos; una pérdida de la inducción SOS; sensibilidad a los agentes que dañan el ADN y que causan DSB; y baja viabilidad celular37. Por lo tanto, proponemos que la población O2v1:KL64 portadora de la mutación recC se había vuelto más diversa a través de una recombinación más frecuente y al capturar más MGE como se detectó en este estudio, y O2v1:KL64-hvKP fue seleccionado y se volvió prevalente en un corto tiempo. escala.

Además, la transferencia horizontal de genes se identificó como otra fuerza impulsora para la diversificación en ST11, ya que se detectó una carga significativamente mayor de MGE, incluidos plásmidos, IS y profagos, en O2v1: KL64 en comparación con OL101: KL47 (Figura complementaria 5a). -d). Se sabe que las presiones selectivas inducidas por fagos desempeñan un papel crítico en la diversidad de la población de bacterias13, y encontramos que la carga de profagos fue significativamente mayor en O2v1:KL64 que en OL101:KL47 debido a múltiples eventos de ganancia y pérdida (Fig. 4c ). Estos hallazgos sugieren que los dos subclones podrían haber estado expuestos de manera heterogénea a diferentes tipos de fagos. En particular, nuestro análisis señala que los profagos de Siphoviridae contribuyeron significativamente a la alta carga de profagos en O2v1: KL64, que probablemente resultó de un único evento de adquisición a través del modelo vertical (Fig. 4d). De manera similar, la expansión a gran escala de plásmidos e IS dentro de O2v1: KL64 también se relacionó con un evento de adquisición único seguido de herencia vertical (Fig. 4b, c). La transmisión vertical de estos MGE sugiere que pueden haber conferido ventajas evolutivas a O2v1:KL64, lo que podría estar respaldado aún más por los genotipos "exitosos" identificados que portan estos MGE (Fig. 6). Dado que los genomas ST11 albergan más MGE que los no ST11 en nuestra colección (Figura 6 complementaria), proponemos que la acumulación de profagos y plásmidos podría ser uno de los factores vitales para el éxito epidémico de los clones exitosos. A pesar de los beneficios que pueden proporcionar los genes de carga (p. ej., AMR) transportados por las MGE, la introducción de nuevas MGE en un fondo genético preexistente y bien sintonizado incurriría en un costo de aptitud, y el mantenimiento de las MGE en las células huésped requiere un equilibrio. de los costos y beneficios para el anfitrión38, por ejemplo, minimizados con el tiempo mediante la selección39. Sería interesante explorar los mecanismos subyacentes empleados por O2v1:KL64 para ajustar los costos de aptitud introducidos por estos MGE. Además, los estudios futuros deberían implicar el examen de la función biológica de estos elementos genéticos para comprender su papel en el éxito a nivel poblacional de O2v1:KL64.

Lo que es más preocupante, utilizando un método de seguimiento de transmisión basado en SNP, revelamos que la prevalencia de O2v1:KL64-hvKP fue impulsada por un patrón de transmisión alterado. La precisión de los métodos de seguimiento de la transmisión basados ​​en SNP ha sido evidenciada recientemente por numerosos estudios que utilizan grandes conjuntos de datos para diversos patógenos, como MRSA y CRKP7,16,40. En particular, aquí utilizamos una variedad de límites de SNP para evitar cualquier sesgo que pudiera ser causado por un solo límite. De hecho, todos los límites de SNP utilizados en nuestro análisis generaron una tendencia de transmisión consistente, lo que demuestra la confiabilidad y validez de nuestros resultados. La propagación de O2v1:KL64-hvKP fue impulsada principalmente por una transmisión intrahospitalaria antes de 2018, lo que podría atribuirse a las ventajas evolutivas conferidas por un conjunto de alteraciones genéticas como las identificadas aquí. Con el tamaño cada vez mayor de O2v1:KL64-hvKP a lo largo del tiempo, las transferencias de pacientes entre hospitales pueden haber facilitado aún más la propagación de la subpoblación por todo el país, lo que llevó a un cambio posterior a la transmisión interhospitalaria. Se necesitan más metadatos para descubrir las razones de los cambios en el modo de transmisión en el futuro. Nuestros hallazgos resaltan la necesidad de adaptar las medidas actuales de control de infecciones (p. ej., detección activa de pacientes transferidos entre hospitales con antecedentes de CRKP) para prevenir la diseminación de O2v1:KL64-hvKP en China.

En resumen, hemos demostrado aquí que el reemplazo subclonal dentro de CRKP-ST11 ha sido impulsado por la expansión de O2v1:KL64 en un período de 6 años en China. El éxito epidémico de O2v1:KL64 se asocia con la aparición y diseminación de una subpoblación asociada con un repertorio de alteraciones genéticas y, lo que es más preocupante, con una mayor transmisión interhospitalaria. En conjunto, nuestro estudio destaca que los esfuerzos de salud pública deben centrarse en la vigilancia genómica para identificar clones de alto riesgo y expansiones subclonales en las primeras etapas del curso de una epidemia para potenciar estrategias de control específicas.

Se recolectaron un total de 4635 aislamientos no duplicados en el marco de la vigilancia nacional de aislamientos sanguíneos (Sistema Colaborativo de Investigación de Resistencia a Bacterias Sanguíneas, BRICS) entre enero de 2014 y diciembre de 2019 en China (Fig. 1a). Sólo el primer aislado de sangre de cada especie por paciente fue elegible durante todo el período del estudio. Todos los hospitales participantes enviaron trimestralmente sus aislamientos al laboratorio central. La identificación de especies se realizó mediante espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización/desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF/MS) (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Alemania). El aumento en el número de aislamientos a lo largo del tiempo se debió en parte a mejoras en el control de calidad por parte de los hospitales participantes durante el período de vigilancia. El protocolo de recolección de muestras fue aprobado por la junta de revisión institucional del Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Zhejiang en China.

Las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos se realizaron inicialmente utilizando un sistema VITEK-2 (bioMérieux, Lyon, Francia) en los hospitales centinela y se confirmaron posteriormente mediante el método de dilución en agar y/o microdilución en caldo en nuestro laboratorio. Los resultados se interpretaron de acuerdo con el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio41 y el Comité Europeo sobre Pruebas de Susceptibilidad a los Antimicrobianos v.10.0 (http://www.eucast.org/clinical_breakpoints/). La resistencia a carbapenem se definió como una concentración mínima inhibitoria (CMI) de ≥4 mg/l para imipenem o meropenem.

El ADN genómico de 794 aislados de CRKP se extrajo utilizando Gentra Puregene Yeast/Bact. Kit (Qiagen, San Francisco/Área de la Bahía, CA, EE. UU.). Los genomas se secuenciaron utilizando un sistema Illumina Novaseq 6000 (Illumina, San Diego, Estados Unidos) con bibliotecas de extremos emparejados de 2 × 150 pb. Las lecturas sin procesar se recortaron con Trimmomatic v0.3342 y luego se ensamblaron con SPAdes v3.12.043. Realizamos una secuenciación de lectura larga en aislados representativos utilizando una plataforma Nanopore PromethION (Nanopore, Oxford, Reino Unido) siguiendo un protocolo de biblioteca de 10 Kbp. Se generó un ensamblaje híbrido utilizando Unicycler 0.4.044 con lecturas cortas y largas. Se utilizó QUAST v4.6.045 para generar estadísticas de ensamblaje. Las especies se determinaron utilizando FastANI v1.33 (https://github.com/ParBLiSS/FastANI), con un límite del 95%. Los ensamblajes se anotaron utilizando Prokka v1.14.646.

Los ST se asignaron usando Kleborate v2.0.147 y el tipo K/O se determinó usando Kaptive v1.048 del ensamblaje de novo.

Los ARG se detectaron utilizando Abricate v1.0.1 (https://github.com/tseemann/abricate) con la base de datos de ARG ResFinder v4.049. Los VF de K. pneumoniae se descargaron de K. pneumoniae BIGSdb50 y Virulence Factor Database 2019 (VFDB)51, y la presencia de VF se detectó utilizando BLASTp v2.6.0 (identidad ≥70%) con la base de datos de VF personalizada que contiene 154 VF. genes (Conjunto de datos complementario 3). La tipificación de replicones se realizó utilizando Abricate v1.0.1 con la base de datos PlasmidFinder52. La presencia de integrones se detectó utilizando IntegronFinder v1.5.153. Los números de copias de IS se estimaron con la función de llamada TPM de TPMCalculator v0.0.354 y se corrigieron mediante el TPM de gapA (un gen de mantenimiento). Los profagos se detectaron y clasificaron utilizando phigaro v2.2.655. El estado ancestral de cada MGE se reconstruyó con máxima probabilidad utilizando la función fastAnc en el paquete R phytools v.0.4-9856.

El análisis de recombinación se realizó utilizando Gubbins v2.257. Los archivos de salida de Gubbins se utilizaron para calcular la r/m y los recuentos medios de recombinación por base, calculados en ventanas de 1000 pb que no se superponen. La divergencia de nucleótidos por pares entre regiones del genoma central específicas de subclones se calculó para cada par de genomas dentro de un subclon antes y después de la eliminación de supuestas regiones recombinantes.

Para la manipulación genética se utilizó un aislado representativo de O2v1:KL64, KP37485. Todos los cebadores utilizados en este estudio se enumeraron en el conjunto de datos complementario 10. Para la construcción eliminatoria, el fragmento de ADN recC-espaciador se clonó en un vector pSGKP-apr58 y se utilizó el oligonucleótido sintético con 45 nt para cada extensión de homología del gen diana. como modelo de donante. Tanto el plásmido espaciador pSGKP-recC como el ADN molde del donante se transformaron en KP37485 que alberga pCasKP mediante electroporación, y la integración se seleccionó en placas LB que contenían sacarosa al 5% a 37 °C. Para el reemplazo del gen, se amplificó un fragmento lineal que contenía un gen cat con su promotor nativo del plásmido pKD359 entre los 45 nt de cada extensión de homología de recC y se usó como plantilla donante, y se seleccionó el KP37485-recC::cat-pCasKP resultante. en placas LB que contienen 5% de sacarosa más 25 mg/L de cloranfenicol y 30 mg/L de apramicina a 30 °C. El oligonucleótido sintético con recCOL101:KL47 así como su extensión de homología de 45 nt cada uno se usó como plantilla donante y se transformó en KP37485-recC::cat-pCasKP con el plásmido pSGKP-cat-spacer. La integración se seleccionó como se describe en la construcción knockout, además de ser seleccionada por la sensibilidad al cloranfenicol. Para la complementación, los genes se amplificaron mediante PCR y se clonaron en el vector pBAD3360. Los plásmidos resultantes se introdujeron en kp37485ΔrecC mediante electroporación. Se utilizaron PCR y secuenciación de ADN para confirmar las construcciones finales.

Se sabe que la reparación recombinacional del daño del ADN mediada por la vía dependiente de Rec es una estrategia principal para proteger a las bacterias de los agentes que dañan el ADN (p. ej., mitomicina C, bromuro de etidio y rayos UV); por lo tanto, estos agentes se han utilizado ampliamente como indicadores de la capacidad de recombinación11,35,61. La resistencia a la mitomicina C se evaluó como se describió anteriormente con ligeras modificaciones61. Se cultivaron aislados de K. pneumoniae durante la noche en caldo LB y se inocularon en el caldo fresco con los agentes indicados. Las cepas que albergaban pBAD33 y sus plásmidos derivados se cultivaron en caldo LB con 0,2% (p/v) de l-arabinosa y 25 mg/l de cloranfenicol. Las bacterias se recolectaron en la fase logarítmica tardía y se suspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS), a 5 × 108 unidades formadoras de colonias (ufc) por mililitro. Las suspensiones celulares se trataron con mitomicina C a las concentraciones indicadas durante 1 y 3 h, se diluyeron en serie en PBS, se extendieron en placas LB y se incubaron durante la noche a 37 °C. Se utilizó bacteria tratada con PBS como control negativo. El índice de supervivencia se calculó de la siguiente manera: (UFC del cultivo tratado con mitomicina C/UFC del cultivo tratado con PBS) × 100 %.

El vector suicida pRE118, que transporta el fragmento aguas arriba y aguas abajo de blaKPC-2 del KP37485 y un gen de resistencia a la apramicina apmR, se generó y se sometió a electroporación en huéspedes analizados. Los recombinantes se seleccionaron en placas que contenían 50 mg/l de apramicina y se confirmaron mediante PCR. La frecuencia de recombinación se calculó como el número de recombinantes/el número de receptores.

El ensayo de fagocitosis se realizó como se describió anteriormente en la ref. 62. En resumen, las células THP-1 se diferenciaron a razón de 1 × 106 células/pocillo en una placa de 12 pocillos. Las bacterias en la fase logarítmica media se recolectaron mediante centrifugación (5 min, 6000 rpm, 24 ˚C), se resuspendieron en 1 × PBS y se ajustaron a 5 × 108 UFC/ml. Las infecciones se realizaron utilizando una multiplicidad de infección (MOI) de 50 bacterias por célula. Para sincronizar la infección, las placas se centrifugaron a 200 xg durante 5 minutos y se incubaron a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2. Después de 1 h de contacto, las células se lavaron dos veces con PBS y se cultivaron con RPMI 1640 que contenía FBS al 10 % y gentamicina (100 mg/l). Para determinar la carga bacteriana en la célula, las células se lavaron dos veces con PBS y se lisaron con saponina al 0,5% en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se sembraron diluciones en serie en LB para cuantificar el número de bacterias intracelulares. Todos los experimentos se llevaron a cabo con muestras por triplicado en al menos tres ocasiones independientes.

Los conjuntos de lectura corta se compararon con plásmidos de referencia utilizando BLASTn v2.9.063 para determinar la longitud de la secuencia del plásmido de referencia presente en los aislados. La tipificación y agrupación de replicones se realizaron utilizando MOB-suite15. Se circularon plásmidos representativos mediante PCR y secuenciación de Sanger. Se utilizó la herramienta de comparación Artemis v13.0.064 y/o BRIG65 para comparar y visualizar la variación estructural entre dos o más secuencias. El mapa de calor que muestra el porcentaje de regiones alineadas entre pares de plásmidos de virulencia se generó utilizando el paquete "pheatmap" (v1.0.12) en R v4.1.1 (https://www.r-project.org/).

Las lecturas de secuenciación recortadas de 646 aislados ST11 recopilados en este estudio se asignaron a un genoma de referencia ST11 de K. pneumoniae KP16932 (n.º de acceso QVAN00000000)4 utilizando BWA mem 62 v0.7.10-r789 (parámetros predeterminados). Luego, las lecturas asignadas se limpiaron y ordenaron utilizando la suite SAMtools v1.766. Las lecturas se realinearon con la referencia utilizando GATK v3.767 mediante la creación de objetivos para la realineación (RealignerTargetCreator) y la realización de la realineación (IndelRealigner). La eliminación de duplicados ópticos se completó con Picard v2.10.1-SNAPSHOT (https://broadinstitute.github.io/picard/). Las variantes de secuencia se llamaron utilizando Bcftools v1.9-80 (//samtools.github.io/bcftools) para generar un pseudogenoma basado en referencias para cada genoma con una profundidad superior a 10 ×. Se concatenaron pseudogenomas de alta calidad (se excluyeron las secuencias de plásmidos) antes de utilizar Gubbins v2.257 para eliminar regiones recombinantes y sitios invariables. Se incluyeron cuarenta genomas ST258 (indicados por el triángulo) recuperados de GenBank para establecer la raíz del árbol ST11. La alineación de secuencia múltiple resultante de pseudogenomas basados ​​en referencias (4460 sitios variantes) se utilizó para inferir una filogenia de máxima probabilidad utilizando RAxML-ng v0.6.068 con 100 réplicas de arranque para evaluar el apoyo.

Todos los genomas disponibles de ST11 (n = 329) en GenBank recuperados al 1 de marzo de 2021 se incluyeron en este análisis (conjunto de datos complementario 9). Se utilizó Snippy v4.6.0 (https://github.com/tseemann/snippy) para alinear los 975 genomas con el genoma de referencia KP16932 para generar la alineación de los SNP del genoma central. Gubbins v2.257 detectó SNP ubicados en regiones de recombinación. Los SNP del genoma central libre de recombinación resultantes (3027 sitios variantes) se utilizaron para inferir una filogenia de máxima probabilidad utilizando RAxML-ng v0.6.068 con un modelo GTR y corrección gamma, y ​​se realizaron 100 réplicas de arranque para evaluar el soporte. Se produjo un cronograma utilizando inferencia filogenética bayesiana. Para reducir el tiempo de cálculo, se eligieron para el análisis 147 genomas, incluidos todos los KL. El análisis de las señales evolutivas moleculares temporales para el conjunto de datos se realizó utilizando TempEst v1.569. Se creó una alineación del genoma central libre de recombinación (1995 SNP) utilizando Snippy v4.6.0. Se utilizó BEAST v1.10.470 para crear y ejecutar tres cadenas independientes de 250.000.000 de longitud con un 10% de quemado, registrando cada 25.000 y teniendo en cuenta los sitios invariantes. Incluimos los supuestos previos de un modelo de horizonte bayesiano coalescente para el crecimiento de la población y una frecuencia de reloj logarítmica normal relajada para tener en cuenta la heterogeneidad de tasas entre ramas. La convergencia de la cadena de Markov Monte Carlo (MCMC) se inspeccionó en Tracer v1.7.271, con tamaños de muestreo efectivos de todos los parámetros >200. El árbol de máxima credibilidad de clado (MCC) en cada modelo se generó en TreeAnnotator y se trazó en FigTree v1.4.4 (https://github.com/rambaut/figtree).

Los SNP del genoma central filtrados por recombinación de cada conjunto de datos se generaron como se describe anteriormente para calcular las matrices de distancia de SNP por pares. Para cada par de combinaciones únicas de paciente-centro, solo se incluyó el par de aislados más estrechamente relacionado como distancia genética por pares. Aquí se utilizó una variedad de umbrales para identificar pares de transmisión recientes dentro e entre instalaciones utilizando distancias por pares. El umbral mínimo se determinó como 14 SNP (2 × 5.716.474 × 1,2256 × 10−6) utilizando la longitud del genoma de referencia (5.716.474 pares de bases) y la tasa de mutación (1,2256 × 10−6 mutaciones por par de bases por año estimadas en este estudio), y el umbral máximo se definió como 25 SNP según estudios recientes de transmisión de CRKP7,16,17,18. Este análisis se realizó utilizando el paquete regentrans72 en R v4.1.1.

Se realizaron las pruebas de suma de rangos de Wilcoxon y las pruebas de Chi-cuadrado para comparaciones de grupos por pares de MGE, VF, ARG y coeficiente de Pearson. Las pruebas t de Student se utilizaron para comparaciones de grupos por pares en ensayos fenotípicos. Se utilizó la prueba de Mann-Kendall para comprobar las tendencias de transmisión. Los valores de p <0,05 se consideraron significativos. Todos los análisis estadísticos se implementaron en R v4.1.1.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos de secuencia de Illumina ensamblados se han depositado en GenBank con el número de acceso de BioProject PRJNA778807. Los números de acceso individuales también están disponibles en el Conjunto de datos complementario 1. Los datos originales se proporcionan con este documento.

El código personalizado utilizado en este estudio está disponible gratuitamente en https://github.com/xuechunxu/CRKP_ST11_KL64 (https://doi.org/10.5281/zenodo.7804081).

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Agradecemos a Jingjie Song y Yang Liu por su apoyo técnico en bioinformática. También agradecemos a Jinru Ji y Chaoqun Ying por preparar los metadatos de la colección. Este trabajo fue financiado por el Programa Nacional Clave de Investigación y Desarrollo de China con los números de premio 2021YFC2300300 (para KZ e YX) y 2022YFE0103200 (para KZ), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China con los números de premio 81902030 (para TX), 81971984 (para YX) , y 82172330 (a KZ), China Postdoctoral Science Foundation con el número de concesión 2022M712187 (para C.-XX), proyectos clave de investigación básica de Shenzhen con el número de concesión JCYJ20200109144220704 (para KZ), proyectos de investigación básica de Shenzhen con el número de concesión JCYJ20190807144409307 (para KZ) , los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales con el número de concesión 2022ZFJH003 (a YX) y el Proyecto de Investigación del Laboratorio de Biomedicina Microecológica de Shandong de Jinan con el número de concesión JNL-2022027C (a YX).

Estos autores contribuyeron igualmente: Kai Zhou, Chun-Xu Xue, Tingting Xu, Ping Shen.

Instituto de Enfermedades Respiratorias de Shenzhen, Hospital Popular de Shenzhen (Segunda Facultad de Medicina Clínica, Universidad de Jinan; Primer Hospital Afiliado, Universidad de Ciencia y Tecnología del Sur), Shenzhen, 518020, China

Kai Zhou, Chun-Xu Xue, Tingting Xu, Sha Wei y Jinquan Liu

Laboratorio Estatal Clave para el Diagnóstico y Tratamiento de Enfermedades Infecciosas, Centro Nacional de Investigación Clínica para Enfermedades Infecciosas, Centro Médico Nacional para Enfermedades Infecciosas, Centro de Innovación Colaborativa para el Diagnóstico y Tratamiento de Enfermedades Infecciosas, Primer Hospital Afiliado, Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang, Hangzhou, 310003, China

Ping Shen, Yunbo Chen y Yonghong Xiao

Departamento de Enfermedades Infecciosas, Escuela Clínica Central, Universidad de Monash, Melbourne, VIC, 3004, Australia

Kelly L. Wires, Margaret MC Lam y Kathryn E. Holt

Departamento de Laboratorio Clínico, Hospital Popular de Shenzhen, Shenzhen, China

haoyun lin

Departamento de Biología de Infecciones, Facultad de Enfermedades Infecciosas y Tropicales, Escuela de Higiene y Medicina Tropical de Londres, Londres, WC1E 7HT, Reino Unido

Kathryn E. Holt

El primer hospital afiliado de la Universidad de Zhejiang, Hangzhou, China

Yunbo Chen

Hospital central de la ciudad de Lishui, Lishui, China

Hui Ding

Hospital afiliado de la Facultad de Medicina de Binzhou, Binzhou, China

Yongyun Liu

el Primer Hospital Popular de Lianyungang, Lianyungang, China

Haifeng Mao

Primer hospital afiliado de la Universidad Médica de Anhui, Hefei, China

Ying Huang

Hospital Yijishan de esta facultad de medicina, Wuhu, China

Zheng Hai Yang

Hospital provincial de Anhui, Hefei, China

Yuan Yuan Dai

Hospital Wuhan Puren, Wuhan, China

Guolin Liao

El primer hospital popular de Jingzhou, Jingzhou, China

Lisa Zhu

Hospital Popular de la Región Autónoma Hui de Ningxia, Yinchuan, China

Liping Zhang

Hospital del distrito de Anyang de la provincia de Henan, Anyang, China

Yanhong Li

El Segundo Hospital Popular de la Provincia de Yunnan, Kunming, China

Hongyun Xu

Hospital Provincial de Medicina Tradicional China de Zhejiang, Hangzhou, China

Junmin Cao

Hospital Popular de la ciudad de Huangshan, Huangshan, China

Baohua Zhang

Hospital Mindong de la ciudad de Ningde, Ningde, China

Liang Guo

Hospital afiliado de la Universidad Médica de Jining, Jining, China

Haixin Dong

Hospital Popular de Qingyang, Qingyang, China

Shuyan Hu

Hospital Popular del Centro de Tengzhou, Tengzhou, China

Hombre Sijin

Hospital Popular de Lu'an, Lu'an, China

Lu Wang

Hospital Youyi de la Región Autónoma Uygur de Xinjiang, Urumqi, China

Zhixiang Liao

Hospital Popular de la ciudad de Yichun, Yichun, China

Rong Xu

Primer hospital popular de Jiujiang, Jiujiang, China

Dan Liu

Hospital Provincial de Shandong, Jinan, China

Yan Jin

Hospital central de Jingzhou, Jingzhou, China

Yizheng Zhou

el primer hospital afiliado de la Universidad Médica de Gannan, Ganzhou, China

Yiqun Liao

El primer hospital de la ciudad de Putian, Putian, China

Feng Hong Chen

Hospital Popular de la ciudad de Haining, Haining, China

Beijing Gu

Hospital central del yacimiento petrolífero de Shengli, Dongying, China

Jiliang Wang

Hospital afiliado Hongqi de la Facultad de Medicina de Mudanjiang, Mudanjiang, China

Jinhua Liang

Hospital afiliado de la Facultad de Medicina de Ningbo, Ningbo, China

Lin Zheng

Hospital de Mujeres, Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang, Hangzhou, China

Aiyun Li

El Cuarto Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Anhui, Hefei, China

Jilu Shen

Hospital Popular de la ciudad de Tianchang, Chuzhou, China

Yinqiao Dong

Hospital Popular Provincial de Shanxi, Taiyuan, China

Lixia Zhang

El primer hospital afiliado de la Universidad de Ciencia y Tecnología de Henan, Luoyang, China

Hongxia Hu

El Segundo Hospital Popular de Jingzhou, Jingzhou, China

Bo Quan

Hospital civil de Lu'an, Lu'an, China

Wencheng Zhu

El segundo hospital afiliado de la Facultad de Medicina de Bengbu, Bengbu, China

Kun Peng Liang

Hospital Huaihe de la Universidad de Henan, Kaifeng, China

Qiang Liu

Hospital Infantil Qilu de la Universidad de Shandong, Jinan, China

Shifu Wang

Tercer hospital popular de Zigong, Zigong, China

Xiao Ping Yan

el Segundo Hospital de la Universidad Médica de Shanxi, Taiyuan, China

Jiangbang Kang

el Hospital Popular de Lujiang, Hefei, China

Xiusan Xia

el Primer Hospital Popular de Jiayuguan, Jiayuguan, China

Lan Ma

El tercer hospital de Hefei, Hefei, China

Li Sol

Hospital General del Comando del Teatro del Norte, Shenyang, China

Liang Luan

Hospital Xingang de Xinyu, Xinyu, China

Jianzhong Wang

Hospital Popular de Shenzhen, Shenzhen, China

haoyun lin

El primer hospital afiliado de la Universidad Médica de Xi'an, Xi'an, China

Zhuo Li

Hospital Provincial de Medicina Tradicional China de Gansu, Lanzhou, China

Dengyan Qiao

Primer Hospital Popular de Chenzhou, Chenzhou, China

Lin Zhang

Instituto de Exámenes de Medicina de Changshu, Changshu, China

Chuandan Wan

Hospital de mujeres y niños del distrito de Jin'an, Lu′an, China

Xiao Yan Qi

Hospital Hubin de Hefei, Hefei, China

fei du

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KZ, YX y KEH concibieron el proyecto y revisaron el manuscrito. El Grupo de Trabajo BRICS recopiló aislados bacterianos y datos epidemiológicos y realizó análisis de laboratorio preliminares. KZ, C.-XX, PS, YC, KLW y MMCL realizaron el análisis de los datos. TX, SW, JL, HL y PS realizaron los experimentos. KZ escribió el manuscrito. KZ e YX son el garante de este trabajo y, como tal, tuvieron acceso completo a todos los datos del estudio y asumen la responsabilidad de la integridad de los datos y la precisión del análisis de los mismos. Todos los autores leyeron y aprobaron la versión final del manuscrito.

Correspondencia a Kai Zhou o Yonghong Xiao.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de revisión por pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Zhou, K., Xue, CX., Xu, T. et al. Una mutación puntual en recC asociada con el reemplazo subclonal de Klebsiella pneumoniae ST11 resistente a carbapenémicos en China. Nat Comuna 14, 2464 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38061-z

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Recibido: 26 de diciembre de 2022

Aceptado: 13 de abril de 2023

Publicado: 28 de abril de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38061-z

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